Eficàcia dels tocotrienols com a estratègia de tractament de la fibrosi intestinal

Abstract

En el patró fibroestenosant de la malaltia de Crohn els fibroblasts intestinals augmenten en número contribuint al desenvolupament de la fibrosi. Un dels principals promotors de la proliferació d’aquestes cèl•lules és el bFGF. En el present estudi la fracció rica en tocotrienol ha demostrat tenir efectes antiproliferatius en fibroblasts intestinals humans independentment de la procedència dels fibroblasts. Els tocotrienols redueixen tant la proliferació basal com la induïda per bFGF en fibroblasts.

L’apoptosi de les cèl•lules efectores en el desenvolupament de la fibrosi sembla ser el principal mecanisme de la seva resolució. Els tocotrienols instauraren un procés complert d’apoptosi en els fibroblasts. A diferència del que passa amb la majoria d’agents proapoptòtics, els tocotrienols provoquen l’activació tant de la via extrínseca com de la via intrínseca de l’apoptosi ja que activa les caspases 8 i 9. Sorprenentment, l’addició de ciclosporina A (CsA), un conegut inhibidor de la via intrínseca de l’apoptosi, bloqueja completament el procés d’apoptosi induït per FRT. Això demostra que tot i l’activació de la caspasa 8 i per tant, de la via extrínseca, en el tractament amb tocotrienols la predominant és la via intrínseca. L’autofàgia té un paper molt rellevant en l’aclariment de cossos apoptòtics. Els tocotrienols han demostrat eficàcia en la inducció d’autofàgia en fibroblasts, ja que provoca la maduració de la proteïna LC3 i l’aparició de vacuoles autofàgiques en el citoplasma d’aquestes cèl•lules. Un cop més la CsA reverteix aquest procés, i per tant inhibeix l’autofàgia, demostrant que aquest procés requereix la participació de la mitocòndria.

Les patologies que cursen amb desenvolupament de fibrosi estan associades a alts nivells de TGF-β que resulta en el reclutament de fibroblasts al lloc de la lesió i a un increment en la producció de matriu extracel•lular. A nivell intracel•lular, la fosforilació d’Smad3 és el pas clau que regula les accions del TGF-β. Els tocotrienols han mostrat eficàcia en la disminució dels nivells intracel•lulars d’Smad3 fosforilada induïda per TGF-β.

La fosforilació d’Smad3 té efectes oposats en la regulació de l’expressió gènica. Regula positivament l’expressió de TIMP-1, en canvi, regula negativament l’expressió de MMP-3. Tot i ser efectes oposats en quant a expressió gènica, aquests dos fenòmens afavoreixen l’acumulació de matriu extracel•lular. L’exposició a tocotrienols fa que es reverteixi aquest estat profibrogènic ja que indueix l’expressió de MMP-3 però no afecta als nivells de TIMP-1. La síntesi de MEC i especialment la síntesi de COL1, COL3 i COL5 està incrementada en la fibrosi intestinal, aquest fet està directament relacionat amb l’activitat de TGF-β en la zona afectada. Els tocotrienols interfereixen en la síntesi de col•lagen.

A més, els tocotrienols disminueixen la fosforilació d’Smad3 induïda per TGF-β, un fet clau en la síntesi de matriu extracel•lular.

Aquests resultats permeten hipotetitzar un potencial antifibrogènic dels tocotrienols. Per a confirmar aquest potencial “in vivo” ens calia disposar d’un model experimental de fibrosi intestinal. A diferència del que succeeix amb la colitis, en la que es disposa d’un gran nombre de models animals, hi ha pocs models experimentals específicament dissenyats per a reproduir la fibrosi intestinal. Aquest fet, ha limitat molt el desenvolupament de noves estratègies de tractament antifibrogènic en l’intestí.

Mitjançant l’administració intracolònica repetida a dosis baixes de l’haptè TNBS vam poder establir fibrosi intestinal en la rata de manera rellevant i reproduïble.

En aquest model de fibrosi intestinal, els animals que van rebre la dosi més alta de tocotrienols provada en aquest estudi van mostrar nivells disminuïts en paràmetres que mesuren la inflamació, això és, es va disminuir l’índex d’activitat de la malaltia i la pèrdua de pes causada pel TNBS així com també va reduir l’expressió de TNF-α.

Excessive fibroblast expansion and extracellular matrix deposition are key events for the development of bowel stenosis in Crohn’s disease patients. Tocotrienols are vitamin E compounds with proven in vitro antifibrogenic effects on rat pancreatic fibroblasts. We aimed at investigating the effects of tocotrienols on human intestinal fibroblast proliferation, apoptosis, autophagy, and synthesis of ECM.

Intestinal fibroblasts isolated from patients with Crohn’s disease were treated with tocotrienol-rich fraction from palm oil.

Tocotrienols significantly reduced proliferation, enhanced cell death by promoting apoptosis and autophagy. Fibroblast apoptosis, but not autophagy, was prevented by the pan-caspase inhibitor zVAD-fmk, whereas both types of cell death were prevented when the mitochondrial permeability transition pore was blocked by cyclosporin A, demonstrating a key role of the mitochondria in these processes. TRF diminished procollagen type I and laminin γ production these cells.

Transforming growth factor-β plays a key role in matrix deposition during fibrosis. Treatment of intestinal fibroblasts with tocotrienol rich fraction prevents Smad3 phosporylation induced by transforming growth factor-β and reduces collagen type 1 and 3 production by these cells.

Besides, in a rat model of intestinal fibrosis, treatment with tocotrienols reduces diarrhea, rectal bleeding and weight loss, as well as levels of colonic tumor necrosis factor-α and vimentin expression demonstrating that this compound has anti-inflammatory effects in vivo.