Receptores de dopamina y heterómeros de receptores de dopamina en la modulación de la neurotransmisión

Abstract

La mayoría de los ligandos de GPCR que actúan como agonistas, antagonistas o agonistas inversos, se unen al mismo dominio del receptor reconocido por los agonistas endógenos, es decir, el lugar de unión ortostérico. Muchos GPCR poseen sitios alostéricos topográficamente distintos a los ortostéricos. Esto ha llevado a la identificación y estudio de ligandos que actúan como moduladores alostéricos, que pueden regular indirectamente la actividad de los ligandos ortostéricos y/o mediar directamente efectos agonista/antagonista. Este es el caso del híbrido trans-indoloquinolicidina-péptido 28 (IP28) estudiado en la primera parte de esta Tesis Doctoral. Este compuesto es un modulador alostérico de los receptores de dopamina D1, actuando como ligando ortostérico para los receptores D2, D3, D4 y D5 de dopamina; disminuyendo la afinidad del ligando y la potencia de los receptores, preservando al mismo tiempo la eficacia de los mismos y actuando como un agonista débil por si mismo. A pesar de una cierta resistencia inicial por parte de la comunidad científica, la existencia de heterómeros entre diversos receptores de neurotransmisores y neuromoduladores es, hoy por hoy, un hecho aceptado. La heteromerización implica cambios en la forma de entender la neurotransmisión. Así, los receptores no pueden considerarse como una única unidad funcional, sino como agregados multimoleculares localizados en el plano de la membrana plasmática. Bajo esta idea, en la segunda parte de esta tesis se demostró que los receptores de dopamina D2S, D4.2 y D4.4, pero no la variante D4.7 asociada con el trastorno de déficit de atención e hiperactividad (ADHD), forman heterómeros funcionales en células transfectadas y en cerebro de ratón. La coestimulación de los receptores D2S y D4 en el heterómero D2S-D4 tiene un efecto sinérgico en la señalización, hecho que no ocurre en células que expresaban la variante D4.7 o en el estriado de ratones mutados (knock-in) portadores de la variante de 7 repeticiones (D4.7) en el tercer bucle intracelular del receptor D4 de dopamina. Estos resultados indican una diferencia funcional de la variante D4.7 del receptor D4 respecto a las variantes D4.2 y D4.4, la cual puede tener implicaciones importantes para la comprensión de la patogénesis de ADHD. Otra particularidad del receptor de dopamina D4 es que es el único receptor dopaminérgico en la glándula pineal de rata sin que se conozca cual es su función a pesar de que se expresa de manera circadiana. Por tanto, la glándula pineal de rata es una región del cerebro con gran interés para investigar las características del receptor D4. Dado que la glándula pineal está bajo el control de los receptores α1B y β1 adrenérgicos, de cuya activación depende la regulación del ritmo circadiano y la síntesis y liberación de serotonina y melatonina, una posibilidad es que los receptores de dopamina D4, que en animales no presenta formas polimórficas, puedan modular la función de los receptores adrenérgicos de la glándula pineal mediante un proceso de heteromerización. Basado en esta hipótesis, en la tercera parte experimental de esta tesis se ha identificado un nuevo mecanismo que describe como la dopamina regula la función de los receptores adrenérgicos durante el ritmo circadiano. Utilizando diversas técnicas experimentales se ha puesto de manifiesto que: 1) los receptores D4 de dopamina forman heterómeros con receptores adrenérgicos α1B y β1 en células transfectadas y en la glándula pineal 2) los heterómeros α1B-D4 y β1-D4 permiten la modulación inducida por agonistas y antagonistas del receptor D4 de la activación de MAPK y Akt mediada por agonistas de los receptores adrenérgicos en células transfectadas y en la glándula pineal 3) la síntesis y la liberación de serotonina y melanina, promovida por la estimulación de los receptores adrenérgicos en la glándula pineal, está controlada por el receptor D4 a través de la activación de los heterómeros α1B-D4 y β1-D4, y 4) la modulación de los heterómeros a través de los receptores D4 depende de los ciclos circadianos de día/noche. La búsqueda de ligandos específicos para receptores que puedan acoplarse a un sistema de transferencia de energía es de gran interés, ya que las técnicas de BRET y FRET no son aplicables a tejidos ex vivo. Debido a ello, en la cuarta y última parte de esta Tesis se ha querido contribuir al desarrollo de ligandos para receptores de dopamina útiles para detectar heterómeros que contengan estos receptores. Para ello se ha desarrollado y caracterizado ergopéptidos biotinilados como herramientas para el estudio de heterómeros que contengan receptores de dopamina. Así pues, se ha utilizado una quimioteca de ergopéptidos unidos a biotina mediante un espaciador apropiado que conservan sus propiedades como ligandos de receptores de dopamina, identificándose el compuesto 13 como un agonista de elevada afinidad para los receptores D1, D2 y D3 de dopamina y convirtiéndose así en una herramienta útil para estudiar heterómeros que contengan estos receptores.

In the first part of this thesis, we obtained a trans-indoloquinolizidine-peptide hybrid (IP28) obtained by a combinatorial approach, behaved as an orthosteric ligand of all dopamine D2- like receptors (D2, D3, and D4) and dopamine D5 receptors, but as a negative allosteric modulator of agonist and antagonist binding to striatal dopamine D1 receptors. Indoloquinolizidine-peptide 28 induced a concentration-dependent hyperbolic increase in the antagonist apparent equilibrium dissociation constant values and altered the dissociation kinetics of dopamine D1 receptor antagonists. In the second part of this thesis, we show that whereas the most frequent 4-repeat (D4.4) and the 2-repeat (D4.2) variants form functional heteromers with the short isoform of the dopamine D2 receptor (D2S), the 7-repeat risk allele (D4.7) does not. D2 receptor activation in the D2S–D4 receptor heteromer potentiates D4 receptor- mediated MAPK signaling in transfected cells and in the striatum, which did not occur in cells expressing D4.7 or in the striatum of knockin mutant mice carrying the 7 repeats of the human D4.7 in the third intracellular loop of the D4 receptor. Using the same receptor, le dopamine D4R, in the third part of this thesis, we describe that the production of both melatonin and serotonin by the pineal gland is regulated by a circadian-related heteromerization of adrenergic and dopamine D4 receptors. Through α1B-D4 and β1-D4 receptor heteromers dopamine inhibits adrenergic receptor signaling and blocks the synthesis of melatonin induced by adrenergic receptor ligands. And this inhibition was not observed at hours of the day when D4 was not expressed. Finally, in the last part of this thesis, we made the systematic derivatization of two ergopeptides with different peptide-based spacers and we realized their evaluation by radioligand binding assays. Selected spacer-containing ergopeptides with minimal biological alteration and a proper anchoring point were further derivatized with a biotin reporter. Detailed characterization studies identified 13 as a biotin ergopeptide maintaining high affinity and agonist behavior at dopamine receptors, being a useful tool for the study of heteromers involving D1R, D2R, or D3R.