Cèl·lules estrellades pancreàtiques: implicació en el procés de transdiferenciació cel·lular endocrina i caracterització del seu secretoma

Abstract

El pàncreas és una glàndula amb una porció tant endocrina com exocrina que regula l'absorció, emmagatzematge i utilització dels nutrients digerits. Concretament, les cèl·lules beta són les responsables del manteniment dels nivells de glucosa de l'organisme, i en el cas de malalties com la diabetis mellitus tipus 1 són destruïdes per mecanismes autoimmunes. Per substituir aquest tipus cel·lular seria interessant aillar cèl·lules troncals adultes i dirigir la seva diferenciació cap a un fenotip de cèl·lula productora d'insulina.<br/>Els transportadors de resistència a multidrogues ABCG2 s'han proposat recentment com a marcadors de cèl·lules troncals en diferents teixits adults. Concretament en el pàncreas, on encara hi ha controvèrsia sobre l'origen i localització de les cèl·lules troncals, aquest marcador podria identificar a la possible població cel·lular troncal amb implicacions en el procés de transdiferenciació endocrina. L'aproximació experimental d'aquesta tesi es basa en aillar la població ABCG2(+) de pàncreas de rata i realitzar una caracterització del seu fenotip i propietats.<br/>Els nostres resultats indiquen que les cèl·lules obtingudes corresponen al fenotip de cèl·lules pancreàtiques estrellades, tant en estat quiescent com en estat actiu. A més, hem detectat la presència de marcadors de diferents tipus de cèl·lules troncals adultes en el cultiu: nestina, NCAM, FGFR1-IIIb, Thy-1,1. Posteriorment hem evaluat la seva capacitat de transdiferenciació en fenotip endocrí, concretament de cèl·lula productora d'insulina, a través del cultiu en Matrigel (matriu extracel·lular comercial) i exendin-4 (anàleg de GLP-1). Aquest tractament indueix en les cèl·lules estrellades en estat quiescent l'expressió del transportador Glut2, les convertases d'insulina PC1/3, PC2, així com la presència de pèptid C i la secreció d'insulina en resposta a estimulació amb glucosa.<br/>La secreció de factors solubles per part de les cèl·lules estrellades amb fenotip actiu és un fet àmpliamente conegut, així que ens vam plantejar caracteritzar mitjançant proteòmica el secretoma d'aquestes cèl·lules, i estudiar possibles efectes paracrins de les molècules identificades sobre la població ductal. El medi condicionat provinent de cèl·lules estrellades pancreàtiques provoca una inhibició significativa de la proliferació de les cèl·lules ARIP tractades, així com canvis d'expressió gènica a les mateixes (disminució del marcador ductal CK19, i increment del factor de transcripció PDX1, crucial en la diferenciació endocrina). Els resultats suggereixen que TGF&#61538;1 secretat per les cèl·lules pancreàtiques estrellades inhibeix la proliferación de les cèl·lules ARIP ductals tractades amb medi condicionat. <br/>De l'estudi del secretoma destaquem la identificació de 37 proteïnes solubles i 24 proteïnes intracel·lulars. Algunes d'aquestes molècules identificades per primera vegada en el secretoma d'aquest tipus cel·lular com PEDF o LIF, podrien exercir els canvis d'expressió gènica observats en les cèl·lules ARIP tractades amb medi condicionat provinent de cèl·lules pancreàtiques estrellades.<br/>En resum, tant les cèl·lules pancreàtiques estrellades com el seu secretoma obren noves vies d'investigació amb implicacions en processos de regeneració pancreàtica.

<i>Numerous studies have reported that certain stem cells are characterized by the expression of ABCG2 transporter. In the present study we aim to identify new ABCG2(+) pancreatic cell populations and to explore their properties. <br/>We isolated and expanded ABCG2(+) cells from pancreata of lactating rats. The expanded cell population demonstrated a phenotype of pancreatic stellate cells (PaSC). The cell culture in Matrigel plus exendin-4, led to an increase in PDX-1 expression and induction of CK19. Moreover, endocrine genes, such as insulin, IAPP, glucagon, GLUT2, chromograninA, and convertases PC1/3, and PC2 were also detected. Immunocytochemical analysis showed co-localization of insulin and C-peptide, while ultrastructural studies revealed the presence of endocrine granules. Insulin secretion of these cells was detected in the cell culture medium. <br/>Active pancreatic stellate cells secrete many soluble factors important in pancreas physiology. Most of them are associated with fibrosis and matrix turnover. However, other roles including paracrine effects on &#61538; cell progenitors have not been investigated. In pancreas, there is no consensus on the nature of the adult pancreatic stem cells or where these progenitors are located. Ductal cells with capacity of transdifferentiation into endocrine phenotype have been described, but the external and morphogenic signals that determine their differentiation are still unknown.<br/>Subsequently, we characterized for the first time the PaSC secretome, and we identified 61 proteins using two-dimensional electrophoresis (2D) coupled to mass spectrometry MALDI-TOF and peptide mass fingerprinting. The conditioned media from the obtained PaSC was used to culture ARIP ductal cell line for 24 or 72 hours, and we analysed possible changes in a proliferation and differentiation level. We concluded that this media can reduce by 40% ARIP proliferation without affecting their viability, and the molecule responsible of that effect is TGF&#61538;1 secreted by PaSC. This conditioned media also reduces 0,48-fold ductal marker CK19 mRNA expression, and can increase 5,4-fold PDX1 mRNA in this cell line, a transcription factor crucial in pancreatic endocrine differentiation. We localize in the PaSC secretome several novel proteins that could be involved in differentiation processes, such as PEDF, Wnt5b and LIF. </i>