Alteraciones de los Astrocitos en el envejecimiento y en la enfermedad del Alzheimer

Abstract

El tema de esta tesis ha sido el estudio de los mecanismos de neurodegeneración asociados al envejecimiento cerebral y el papel que desempeñan los astrocitos como neuroprotectores utilizando modelos animales in vitro e in vivo.<br/>Los astrocitos son las células más abundantes del sistema nervioso central y su función es muy importante, además de dar soporte trófico a las neuronas tienen una función anticitotóxica y modulan la actividad neuronal. El papel de los astrocitos y su activación en el envejecimiento es un proceso poco conocido. Un mayor conocimiento de esta célula glial puede ayudarnos a entender los cambios fisiopatológicos que conlleva el paso de los años en el cerebro humano. El envejeciemiento cerebral es un factor de riesgo de enfermedades neurodegenerativas y en esta tesis se ha estudiado especialmente la enfermedad de Alzheimer por su alta incidencia en la población de edad avanzada.<br/><br/>En esta tesis hemos establecido y caracterizado dos modelos para el estudio del envejecimiento de los astrocitos in vitro y hemos evaluado su capacidad neuroprotectora.<br/><br/>Primero hemos evaluado los cambios en el estrés oxidativo, la captación de glutamato y la expresión proteica en astrocitos corticales de rata en cultivos de 10 y 90 días in vitro (DIV). Observamos un aumento de estrés oxidativo e inflamación con generación de especies reactivas de oxígeno y una disminución de la actividad mitocondrial a los 90 DIV.<br/><br/>La expresión de las proteínas nitrosiladas, la Cu/Zn-superóxido dismutasa (SOD-1), la hemoxigenasa 1 (HO-1) y la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) aumenta en los astrocitos envejecidos. La captación de glutamato en los astrocitos de 90 DIV era mayor que en los astrocitos de 10 DIV probablemente debido a la regulación al alza del transportador glutamato/aspartato. Los astrocitos envejecidos tenían una menor capacidad de mantener la supervivencia neuronal. Estos hallazgos indican que los astrocitos pueden perder en parte su capacidad neuroprotectora durante el envejecimiento. <br/><br/>En nuestro segundo modelo hemos estudiado los cambios en la fosforilación de tau, el estrés oxidativo y la captación de glutamato en cultivos primarios de astrocitos de la corteza de ratones neonatos de senescencia acelerada SAMP8 comparados con los de ratones resistentes a la senescencia (SAMR1). Hemos demostrado un incremento de la hiperfosforilación de tau y de actividad de quinasa de Gsk3&#946; y Cdk5, que regulan la fosforilación de tau, en los astrocitos de SAMP8. La inhibición de Gsk3&#946; por litio o la de Cdk5 por roscovitina reducen la fosforilación de tau en Ser396. Además, hemos detectado un aumento de estrés oxidativo y una reducción en el potencial de membrana mitocondrial en los astrocitos de los ratones SAMP8. Los astrocitos SAMP8 muestran una disminución en la captación de glutamato comparada con la de los controles SAMR1. Interesantemente, la supervivencia de las neuronas SAMP8 y SAMR1 en cocultivo con astrocitos SAMP8 estaba reducida de manera significativa. Nuestros resultados sugieren que estas preparaciones in vitro son adecuadas para el estudio a nivel molecular y celular de los procesos subyacentes en el envejecimiento temprano de este modelo murino<br/><br/>Además hemos estudiado la función neurotrófica de los astrocitos observando si un aumento de su capacidad neurotrófica mejora la funcionalidad neuronal en el envejecimiento. <br/><br/>El factor neurotrófico derivado de la línea glial (GDNF) fue probado para observar sus efectos neurotróficos contra la atrofia neuronal que causa déficits cognitivos en la vejez. Las ratas envejecidas Fisher 344 con deficiencias en el laberinto de Morris recibieron inyecciones intrahippocampales de un vector lentiviral que codifica GDNF humano en los astrocitos o del mismo vector que codifica la proteína fluorescente verde humana como control. El GDNF secretado por los astrocitos mejoró la función de la neurona como se muestra por aumentos locales en la síntesis de los neurotransmisores acetilcolina, dopamina y serotonina. El aprendizaje espacial y la prueba de memoria demostraron un aumento significativo en las capacidades cognitivas debido a la exposición de GDNF, mientras que las ratas control mantuvieron sus resultados al nivel del azar. Estos resultados confirman el amplio espectro de la acción neurotrófica del GDNF y abre nuevas posibilidades de terapia génica para reducir la neurodegeneración asociada al envejecimiento.<br/><br/>Por último hemos estudiado in vitro e in vivo si en un ambiente de estrés oxidativo, como se produce durante el envejecimiento, los astrocitos tienen una respuesta más elevada al péptido betamieloide.<br/><br/>La neurotoxicidad por el péptido betamieloide (A&#946;) está propuesto como el primer paso de una cascada de eventos perjudiciales para la patología de la enfermedad de Alzheimer (EA). Los efectos tóxicos del A&#946; sobre los astrocitos podrían contribuir a desarrollar cambios neurodegenerativos que conducen a la EA. Hemos estudiado los efectos de A&#946;42 sobre ls cultivos de los astrocitos humanos en la presencia o ausencia de los agentes prooxidantes como butionina sulfoximina (BSO), un inhibidor de síntesis glutatión y FeSO4 que libera hierro redox activo. Condiciones prooxidantes potenciaron la toxicidad del A&#946;, que se demostraron por la generación de radicales libres, cambios inflamatorios y apoptosis en los astrocitos humanos. Un tratamiento similar fue ensayado en la rata in vivo. Una mezcla del A&#946;40 y A&#946;42 o sólo del A&#946;42 fue infundida intracerebroventricularmente durante 4 semanas. Otros grupos animales eran simultáneamente infundidos con BSO y Fe. Un análisis realizado 4 meses más tarde mostró un mayor deterioro cognitivo en el laberinto acuático de Morris con el tratamiento de A&#946; conjuntamente con los tratamientos con agentes prooxidantes. Agentes prooxidantes también potenciaron la patología del tejido cerebral, así los estudios histológicos mostraron una mayor reactividad astroglial, depósitos de A&#946; y daño oxidativo en las neuronas hipocámpicas sensibles a EA.

<i>The subject of this thesis has been the study of neurodegeneration mechanisms associated with the aging brain and the role played by the astrocytes as neuroprotective using animal models in vitro and in vivo. <br/><br/>In the first study, we evaluate the neuroprotective capacity of astrocytes in an in vitro experimental model of aging.Changes in oxidative stress, glutamate uptake and protein expression were evaluated in rat cortical astrocytes cultured for 10 and 90 days in vitro (DIV). Aged astrocytes had a reduced ability to maintain neuronal survival. These findings indicate that astrocytes may partially loose their neuroprotective ability during aging. In the next study, we examine changes in tau phosphorylation, oxidative stress and glutamate uptake in primary cultures of cortical astrocytes from neonatal senescence-accelerated prone mice (SAMP8) and senescence-accelerated resistant mice (SAMR1). Our findings suggest that this in vitro preparation is suitable for studying the molecular and cellular processes underlying early aging in this murine model.In the next study glial cell line derived neurotrophic factor (GDNF) was assayed for its neurotrophic effects against the neuronal atrophy that causes cognitive deficits in old age. Aged Fisher 344 rats with impairment in the Morris water maze received intrahippocampal injections of either a lentiviral vector encoding human GDNF in astrocytes or the same vector encoding human green fluorescent protein as a control. Astrocyte-secreted GDNF enhanced neuron function as shown by local increases in synthesis of the neurotransmitters acetylcholine, dopamine and serotonin. Spatial learning and memory testing showed a significant gain in cognitive abilities due to GDNF exposure, whereas control-transduced rats kept their performance at the chance level. These results confirm the broad spectrum of the neurotrophic action of GDNF and open new gene therapy possibilities for reducing age-related neurodegeneration.<br/><br/>Finally we studied the effects of A&#946; on cultures of human astrocytes in the presence or absence of pro-oxidant agents. Pro-oxidant conditions potentiated A&#946; toxicity, as shown by the generation of free radicals, inflammatory changes and apoptosis. A similar treatment was assayed in rats in vivo. Pro-oxidant agents also potentiate brain tissue pathology. This was demonstrated in histological studies that showed highly increased astrocyte reactivity in AD-vulnerable areas, A&#946; deposits and oxidative damage of AD-sensitive hippocampal neurons. </i>