Identificació, aïllament i caracterització de cèl·lules mare en models de càncer de pròstata

Abstract

El càncer de pròstata és un tipus de càncer de creixement lent, estructura heterogènia, etiologia desconeguda diagnosticat generalment en homes d'edat avançada (>50 anys). Excloent el càncer de pell no melanocític, és el tumor més freqüent (19,6%) en els homes a Catalunya. De manera natural evoluciona cap a la independència hormonal, tot i que es creu que aquesta transició és accelerada pel tractament amb antiandrògens. La interacció entre estroma i epiteli és d'una gran importància per a l'evolució del tumor.<br/><br/>El concepte de cèl·lula mare cancerosa fa referència a una suposada població cel·lular tumoral, amb característiques anàlogues a les de les cèl·lules mare normals, responsable de la generació i manteniment tumorals. La <i>side population</i> (SP), és un conjunt de cèl·lules discriminat per citometria de flux amb capacitat per bombejar certes drogues, xenobiòtics, hormones i altres compostos, que s'ha vist que està enriquida en cèl·lules mare en alguns sistemes.<br/><br/>En aquest treball es va proposar de trobar cèl·lules mare canceroses bàsicament en dos models de càncer de pròstata diferents: les línies cel·lulars <i>LNCaP</i> i <i>PC-3</i> i el model animal <i>PAC-120</i> (xenotrasplantament d'adenocarcinoma hormonodependent que recapitula de manera fiable el càncer de pròstata). Per tal d'assolir el primer objectiu d'identificar-les, es va proposar l'assaig de <i>side population</i>, per tal i com s'ha demostrat la seva validesa per aïllar poblacions enriquides en cèl·lules mare i és un assaig que dóna informació funcional sobre les cèl·lules i en manté la seva viabilitat. A més, aquesta tècnica permetia també assolir el segon objectiu i parcialment el tercer, és a dir aïllarles i caracteritzar-les.<br/><br/>Partint de la hipòtesi nul·la que hi ha cèl·lules amb característiques de cèl·lules mare al càncer de pròstata, els objectius d'aquesta tesi per punts han estat:<br/><br/>1. Identificar i aïllar cèl·lules de la <i>side population</i> tant als tumors del <i>PAC-120</i> com a les línies cel·lulars <i>LNCaP</i> i <i>PC-3</i>.<br/>2. Caracteritzar els perfils gènics de les cèl·lules de la <i>side population</i> aïllades.<br/>3. Comprovar la seva naturalesa progenitora mitjançant assaigs de diferenciació <i>in Vitro</i> o de tumorigènesi <i>in vivo</i>.<br/>4. Analitzar l'existència de cèl·lules tumorals disseminades al moll d'os del model <i>PAC-120</i> i estudiar la seva possible naturalesa progenitora.<br/><br/>Els resultats d'aquest treball demostren que el tumor del model <i>PAC-120</i>, format per una barreja d'epiteli humà i estroma murí, conté cèl·lules de la <i>side population</i> i que els cultius del tumor <i>PAC-120</i> també contenen cèl·lules de la side population. La separació i anàlisi clonal de les cèl·lules de la <i>side population</i> dels cultius revelen que aquestes tenen una capacitat variable de donar lloc a cèl·lules de la <i>side population</i>. A més, l'estudi dels perfils gènics d'aquestes cèl·lules, la seva expressió proteica (immunofenotip Cd45- Sca-1+ Cd81+), la seva adherència al plàstic, la seva morfologia fibroblastoide, la seva gran capacitat proliferativa i la seva capacitat de diferenciació revelen que són cèl·lules multipotents estromals. Per tant, el tumor <i>PAC-120</i> conté cèl·lules multipotents estromals que poden ser aïllades mitjançant l'assaig de la <i>side population</i>. Així mateix, el fenotip SP d'aquestes cèl·lules està associat amb el seu estat de diferenciació, ja que la seva diferenciació en comporta la pèrdua.<br/><br/>D'altra banda, s'ha demostrat que les cèl·lules multipotents estromals aïllades secreten TGF-beta de manera autocrina i tenen la via del TGF-beta activa. El TGF-beta manté la proliferació i inhibeix la diferenciació de les cèl·lules multipotents estromals obtingudes del tumor.<br/><br/>Quant a les línies, en aquest treball s'ha demostrat que tant <i>LNCaP</i> i <i>PC-3</i> contenen cèl·lules de la <i>side population,</i> i presenten RNA i proteïna del transportador ABCG2. El promotor d'<i>ABCG2</i> està parcialment desmetilat a la línia cel·lular <i>LNCaP</i> i molt metilat a <i>PC-3</i>. L'addició del composta bloquejador de la metilació <i>de novo</i> 5-aza afavoreix la desmetilació del promotor d'<i>ABCG2</i>, la transcripció del gen, la traducció de la proteïna i l'augment de la <i>side population</i>. A més, el sèrum i l'estradiol regulen a l'alça la transcripció d'<i>ABCG2</i> i, en el cas del sèrum, també de la <i>side population</i> a la línia cel·lular <i>LNCaP</i>.

<i>Cancer Stem Cells are a distinct cellular population that is believed to be responsible for tumor initiation and maintenance. Recent data suggest that solid tumors also contain another type of stem cells, the mesenchymal stem cells or multipotent mesenchymal stromal cells (MSC), which contribute to the formation of tumor-associated stroma.<br/><br/>The Hoechst 33342 efflux assay has proved useful to identify a rare cellular fraction, named Side Population (SP), enriched in cells with stem-like properties. Using this assay, we identified SP in a prostate cancer xenograft containing human prostate cancer cells and mouse stromal cells. The SP isolation, subculture and sequential sorting allowed the generation of single-cell-derived clones of murine origin that were recognized as MSC by their morphology, plastic adherence, proliferative potential, adipogenic and osteogenic differentiation ability and immunophenotype (CD45-, CD81+ and Sca-1+). We also demonstrated that SP clonal cells secrete transforming growth factor &#946;1 (TGF-&#946;1) and that their inhibition reduces proliferation and accelerates differentiation.<br/><br/>These results reveal the existence of SP in the stroma of a cancer xenograft, and provide evidence supporting their MSC nature and the role of TGF-&#946;1 in maintaining their proliferation and undifferentiated status. Our data also reveal the usefulness of the SP assay to identify and isolate MSC cells from carcinomas.<br/><br/>Concerning to cell lines, previous studies reported the presence of SP in prostate cancer tissues but not in the most widely used prostate cancer cell lines LNCaP and PC3. Using the SP flow cytometric assay, we demonstrate that SP cells are present in LNCaP and PC3 cells and that their abundance change with the serum concentration and steroid ablation. In addition, RT-PCR analysis evidences that ABCG2 is expressed in both cell lines and that its expression significantly increases when LNCaP cells are treated with estradiol (E2) and the demethylation agent 5-aza-2'-deoxycytidine (5-aza-dC). Finally, our results also show that the ABCG2 gene expression relates negatively with the number of methylated CpG islands in its promoter and positively with the abundance of SP in LNCaP cells. In conclusion, these results demonstrate that prostate cancer cell lines LNCaP and PC3 do contain SP cells and express the ABCG2 transporter, and suggest that the changes in the SP abundance in these cell lines most likely reflect the modulation of the transporter activity by the environment than an enrichment in cancer stem cells. </i>