Participació de la Catepsina B, la Catepsina D i l'Esfingomielinasa Àcida en la Fibrosi Hepàtica

Abstract

La fibrosi hepàtica representa un gran problema mèdic amb una taxa significativa de<br/>mortalitat i morbiditat. La fibrosi hepàtica es defineix com una resposta de tancament de<br/>ferida davant d'una varietat d'estímuls crònics. Es caracteritza per una excessiva deposició de proteïnes de la matriu extracel·lular que finalment condueix a la cirrosi hepàtica i la fallida total del fetge.<br/><br/>Les cèl·lules estelades hepàtiques (CEH) són el principal tipus cel·lular responsable de la fibrosi hepàtica. En les hepatopatíes cròniques, les CEH pateixen una transformació fenotípica a un fenotip similar al miofibroblast, que és el responsable de la sobreproducció de proteïnes de la matriu extracel·lular.<br/><br/>Les catepsines son proteases lisosomals que s'han associat amb la destrucció de la matriu extracel·lular en teixits normals i tumorals. Concretament, les catepsines B i D s'han implicat en la progressió del càncer, la invasió cel·lular i la metàstasi. S'han trobat nivells elevats de catepsina B, D i L en sèrums de pacients cirròtics i amb hepatocarcinoma. A més, en un estudi proteòmic en CEH no activades i activades de rata, es va identificar la catepsina D com una de les 21 proteïnes que augmenta la seva expressió durant l'activació de les CEH. Per altra banda, l'Esfingomielinasa Àcida (ASMasa) és un enzim implicat en el metabolisme dels esfingolípids. La ASMasa s'ha vist implicada en processos de mort i proliferació cel·lular. A més, s'ha descrit una<br/>relació entre les catepsines i l'ASMasa en el context de l'apoptosi.<br/><br/>Malgrat aquesta i altres evidències experimentals, no s'ha estudiat en profunditat la<br/>relació de les catepsines i la ASMasa en el context de la fibrosi hepàtica ni l'aportació<br/>d'aquests enzims al canvi de fenotip de les CEH.<br/>Així doncs, l'objectiu global d'aquesta tesi va ser caracteritzar la contribució de la<br/>Catepsina B, la Catepsina D i l'Esfingomielinasa Àcida al fenotip d'activació de les CEH i al procés de fibrosi hepàtica.<br/><br/>L'expressió de la Catepsina B (CtsB), la Catepsina D (CtsD) i l'ASMasa és quasi negligible en les CEH quiescents, però augmenta al llarg del procés de transdiferenciació de les CEH. Aquest augment és paral·lel a l'increment de &#945;- actina de múscul llis (&#945;-SMA) i factor de creixement transformant &#946; (TGF-&#946;) com a marcadors<br/>del procés d'activació de les CEH. Ambdues catepsines són necessàries per la transdiferenciació de les CEH a miofibroblasts, ja que la seva inhibició resulta en una disminució de la proliferació cel·lular i de l'expressió de marcadors fenotípics d'activació de les CEH activades. Per altra banda, la inhibició tant farmacològica com genètica de la ASMasa resulta en la disminució de l'expressió de la CtsB i la CtsD, així com de l' &#945;-SMA. Aquest fenomen no s'observa a la inversa, es a dir, la inhibició de les catepsines no provoca una disminució de la activitat ASMasa. Aquest fet reflexa una jerarquia entre l'ASMasa i les catepsines, on l'ASMasa estaria per sobre de les<br/>catepsines en una possible ruta de senyalització.<br/>Es van obtenir resultats similars tant en CEH de ratolí com en la línia cel·lular de CEH humanes LX2. A més, la inhibició de la CtsB resulta en la disminució de la fosforilació d'AKT induïda per PDGF-BB, principal estímul mitogénic d'aquestes cèl·lules. Per altra banda, la inhibició de l'ASMasa provoca a la seva vegada una disminució de la CtsB i en conseqüència un efecte idèntic al anteriorment descrit, sobre la fosforilació d'AKT. Aquest fet reforça la idea d'una relació íntima entre ambdós enzims.<br/><br/>En el model in vivo de fibrogènesi hepàtica per administració de CCl4 s'observa com l'augment de l'expressió de la CtsB es dóna específicament en CEH però no en hepatòcits. La inhibició farmacològica de la CtsB en aquest model provoca una disminució de la inflamació induïda pel CCl4, de l'activació de les CEH i de la deposició de col·lagen.<br/><br/>Tots els resultats d'aquesta tesi posen en rellevància el paper fonamental de les catepsines i l'ASMasa en l'activació de les CEH, suggerint aquests enzims com a possibles dianes terapèutiques pel tractament de la fibrosi hepàtica.

<i>Liver fibrosis represents a medical problem with a high mortality and morbidity. Liver fibrosis can be defined as a wound healing process against a wide variety of chronic injuries. This process is characterized by an excessive deposition of extracellular matrix proteins that can finally lead to cirrhosis and total liver failure.<br/><br/>Hepatic stellate cells (HSC) are the main cellular type responsible of the scar deposition in the liver fibrosis. During chronic liver injury, hepatic stellate cells suffer a transdifferentiation process from a quiescent to a myofibroblast-like phenotype.<br/><br/>Cathepsins have been best characterized in tumorigenesis and cell death and implicated<br/>in liver fibrosis; however, whether cathepsins directly regulate HSC activation and proliferation, hence modulating their fibrogenic potential, is largely unknown. On the other hand, Acidic Sphingomyelinase (ASMase) is an enzyme implicated in sphingolipids metabolism. ASMase has been related with hepatocellular death and proliferation. Moreover, it has been previously described a relationship between cathepsins and ASMase in the apoptosis context. For all these reasons, the global aim of this thesis was to study the contribution of cathepsins and ASMase to the HSC activation and liver fibrogenesis.<br/><br/>The results show that expression of cathepsin B (CtsB), cathepsin D (CtsD) and ASMase is negligible in quiescent HSCs but parallels the increase of alpha-smooth muscle actin and transforming growth factor-beta during in vitro mouse HSC activation.<br/><br/>Both cathepsins are necessary for HSC transdifferentiation into myofibroblasts, because their silencing or inhibition decreased HSC proliferation and the expression of phenotypic markers of HSC activation, with similar results observed with the human HSC cell line LX2. On the other hand, ASMase inhibition or genetic downregulation by siRNA blunted CtsB/D processing, preventing the activation and proliferation of HSC, CtsB or ASMase inhibition blunted AKT phosphorylation in activated HSCs in response to platelet-derive blunted growth factor. Moreover, during in vivo liver fibrogenesis caused by CCl4 administration, CtsB expression increased in HSCs but not in hepatocytes, and its inactivation mitigated CCl4 induced inflammation, HSC activation, and collagen deposition.<br/>These findings support a critical role for cathepsins and ASMase in HSC activation, suggesting that the antagonism of cathepsins or ASMase in HSCs may be of relevance for the treatment of liver fibrosis. </i>