Phenotypic and Transcriptional Biomarkers In Organ Transplantation

Abstract

This is a compound work comprising two independent studies.<br/><br/>1. Characterization of gamma-delta-T cell subsets in organ transplantation<br/><br/>gamma-delta-T cells are innate-type lymphocytes that preferentially act as regulators of local effector immune responses. Recent reports found an altered distribution of the two main subpopulations of blood gamma-delta-T cells (V-delta-1 and V-delta-2) in operationally tolerant liver transplant recipients. Based on this, gamma-delta-T cells subset quantification was proposed as a biomarker of immunologic risk in liver transplantation. The specific characteristics of gamma-delta-T cell subsets in transplantation remain however unknown. We have investigated here the phenotype, repertoire and functional properties of gamma-delta-T cell subsets in a large population of allograft recipients. Our results indicate that alterations in the gamma-delta-T cell compartment are not restricted to tolerant liver recipients. In fact, most immunosuppressed liver and kidney recipients also display an enlarged peripheral blood gamma-delta-T cell pool mainly resulting from an expansion of V-delta-1 T cells exhibiting an oligoclonal repertoire and different phenotypic and cytokine production traits than V-delta-2 T cells. We propose that persistent viral infections are likely to contribute to these alterations. Our data provide novel insight in the biology of gamma-delta-T cells and a rationale for exploring these lymphocytes in more depth into the pathogenesis of viral infections in transplantation.<br/><br/>2. Comparative Transcriptional and Phenotypic Peripheral Blood Analysis of Kidney Recipients under Cyclosporin A or Sirolimus Monotherapy <br/>Due to its low level of nephrotoxicity and capacity to harness tolerogenic pathways, sirolimus (SRL) has been proposed as an alternative to calcineurin inhibitors in organ transplantation. However, the exact mechanisms underlying its unique immunosuppressive profile in humans are still not well understood. In the current study, we aimed to depict the in vivo effects of SRL in comparison with cyclosporine A (CSA) by employing gene expression profiling and multiparameter flow cytometry on blood cells collected from stable kidney recipients under monotherapy with either SRL or CSA. In addition, the overall effect of these drugs on immunoregulatory pathways was assessed by measuring a transcriptional signature characteristic of operationally tolerant kidney recipients. Samples from SRL recipients displayed an increased frequency of effector memory T cells and were enriched in NFkB-related pro-inflammatory expression pathways and in monocyte and NK cell lineage-specific transcripts. Furthermore neither SRL nor CSA induced a gene expression profile comparable with that of tolerant kidney recipients. In conclusion, we show here that the overall pattern of SRL effect in vivo is dominated by innate immune cells and NFkB-related pro-inflammatory events. These data provide novel insights on the complex effects of SLR on the immune system in clinical transplantation.

<I>"Biomarcadors fenotípics i transcripcionals<br/>en el transplantament d'òrgans"<br/><br/>TEXT: <br/><br/> <br/>1. Estudi de les cèl·lules T gamma-delta A l'al·lotransplantament d'òrgans<br/><br/>1.1 Objectius<br/>- Investigació detallada de la freqüència, fenotip, repertori del TCR i característiques funcionals de les poblacions Vdelta1 i Vdelta2 en sang perifèrica en trasplantats.<br/> - Determinar si l'òrgan trasplantat, la teràpia immunosupressora i la presència d'infeccions víriques influeixen en la distribució i propietats de les subpoblacions gamma-delta.<br/>- Avaluar el valor clínic de la quantificació de les cèl·lules T gamma-delta com a biomarcador diagnòstic de trasplantats tolerants operacionals de fetge. <br/><br/>1.2 Resultats<br/>Es van quantificar les poblacions de gamma-delta totals, Vdelta1, Vdelta2 i ràtio Vdelta1/Vdelta2 en 201 trasplantats de fetge estables (STA-Liver), 29 tolerants operacionals trasplantats de fetge (TOL), 50 trasplantats estables de ronyó (STA-Kidney), 50 malalts amb insuficiència hepàtica terminal (ESLD) i 34 controls sans (CONT). Vem observar un increment de la població gamma-delta total en tots els grups de pacients trasplantats respecte CONT, que venia determinat per un increment de la població Vdelta1, més significatiu en el cas dels TOL, i una disminució de Vdelta2. <br/>Vem demostrar que les freqüències del fenotip són estables en el temps determinant el percentatge d'expressió de Vdelta1 i Vdelta2 dues vegades amb 14 mesos de diferència.<br/>El fenotipatge realitzat a les poblacions Vdelta1 i Vdelta2 en 19 pacients STA-Liver, va mostrar que aquestes subpoblacions expressen marcadors cel·lulars de superfície, intracel·lulars i funcionals diferents entre si. Aquests marcadors, però no serviren per diferenciar una cohort de 9 TOL i 10 STA-Liver. Vàrem assajar la utilitat diagnòstica dels percentatges de Vdelta1 i Vdelta2 per diferenciar TOL i STA-Liver utilitzant una corba ROC. Els resultats no varen ser positius.<br/>Vam correlacionar la freqüència d'infeccions víriques persistents amb la distribució de les subpoblacions T gamma-delta. CMV i HCV, provocaven una alteració independent entre si i significativa en el ràtio Vdelta1/Vdelta2. Vam estudiar, finalment la diversitat clonal del TCR de la població Vdelta1. Es va clonar i seqüenciar la CDR3 del TCR Vdelta1. Els TOL mostren una tendència, estadísticament significativa, cap a un repertori restringit del TCR Vdelta1. Vam determinar si aquestes seqüències de nucleòtids es traduïen en grups d'aminoàcids compartits en la CDR3 de V&#61540;1 però el resultat fou negatiu.<br/><br/>1.3. Conclusions<br/>- La majoria dels receptors d'un transplantament mostren un increment en sang perifèrica de la població de cèl·lules T gamma-delta.<br/>- La distribució alterada en sang perifèrica de les subpoblacions T gamma-delta és estable en un període de temps establert.<br/>- Les infeccions per CMV i HCV afecten la freqüència relativa de les subpoblacions gamma-delta i el ràtio Vdelta1/Vdelta2 en sang perifèrica en pacients trasplantats de fetge.<br/>- Les cèl·lules T Vdelta1 mostren ser fenotípica i funcionalment diferents de les Vdelta2.<br/>- El repertori de CDR3 del receptor de les cèl·lules T Vdelta1 està restringit en receptors de fetge tolerants operacionals.<br/>- Ni la quantificació de subpoblacions T gamma-delta ni la seva caracterització fenotípica permeten discriminar de forma acurada entre TOL i els STA-Liver.<br/><br/>2. Anàlisi fenotípic i transcripcional de receptors d'un transplantament de ronyó en monoteràpia amb CsA o sirolimus<br/><br/>2.1 Objectius<br/>- Establir els efectes in vivo de sirolimus i CsA en sang perifèrica utilitzant tècniques de cribatge d'alt rendiment, per generar un perfil fenotípic i transcripcional de les dues cohorts de pacients.<br/>- Determinar l'expressió d'una sèrie de biomarcadors associats a tolerància en aquests pacients, a partir d'un perfil generat anteriorment en tolerants operacionals renals.<br/><br/>2.2 Resultats<br/>Es varen determinar les diferències fenotípiques de les dues cohorts i vàrem determinar que els pacients tractats amb sirolimus (SRL) mostraven un increment en la població CD4 de memòria efectora (CD45RA-CCR7-) respecte els pacients CSA. El grup SRL també presentava un increment en l'expressió de cèl·lules Tregs (CD4+CD25highFoxp3+) comparat amb CSA.<br/>Vam fer estudis de microarray d'Affymetrix a partir de sang perifèrica. Vam fer un anàlisi comparatiu de dades utilitzant SAM (FDR<5%). El resultat d'aquest anàlisi ens va permetre identificar un total de 486 gens upregulated i 586 gens downregulated en el grup SRL respecte CSA.<br/>Per interpretar el conjunt de gens diferentment expressats vam utilitzar el mètode GSEA, que ens va permetre identificar un enriquiment en el grup SRL de vies de senyalització relacionades amb mTOR i vies pro-inflamatòries comparat tant amb CSA com amb el grup d'individus sans.<br/>Utilitzant Haematolgy Expression Atlas vam identificar una representació significativa de trànscrits específics per monòcits i cèl·lules NK en SRL, i per cèl·lules T CD4+ i limfòcits B en el grup CSA. <br/>El software IPA-Tox va identificar NF&#954;B com la via de senyalització més representativa respecte els gens estudiats.<br/>Per últim vàrem determinar la prevalença de biomarcadors relacionats amb tolerància operacional en pacients trasplantats de ronyót. Dels 37 pacients estudiats només 1 SRL i 3 CSA varen ser predits com a potencialment tolerants.<br/><br/>2.3 Conclusions<br/>- Els receptors estables d'un transplantament de fetge en monoteràpia amb sirolimus presenten un increment significatiu de la població TregFoxp3+ respecte tractament amb CsA.<br/>¬- El perfil d'expressió en sang perifèrica del pacients tractats amb sirolimus mostra un enriquiment en vies metabòliques pro-inflamatòries i gens involucrats ambla senyalització mTOR.<br/>-IPA-Tox identifica, entre les respostes farmacològiques prèviament definides, a NF&#954;B com la via de senyalització més toxicològica a partir dels gens diferentment expressats. <br/>- L'aplicació d'una signature de tolerància operacional prèviament definida no és capaç d'identificar diferències entre els pacients tractats amb CsA i els que reben sirolimus. </I>