Anàlisi de la resposta als tractaments combinats amb cisplatí en el càncer d'ovari: Factors implicats en la quimioresistència

Abstract

El càncer d’ovari (CaOV) és el quart càncer ginecològic més comú després del càncer de mama, endometri i cèrvix i representa la cinquena causa de mort per càncer en la població femenina. El CaOV epitelial (EOC) representa el 90% de tots els tumors ovàrics i és el més letal, amb una mort anual mundial de 115.000 dones, aproximadament. La majoria de les pacients amb CaOV es diagnostiquen quan la malaltia està molt avançada. El tractament es basa en citorreducció quirúrgica seguit de quimioteràpia basada en platí i taxans, però la majoria de les pacients presenten recurrència i acaben morint a conseqüència de la metàstasi. El cisplatí (CDDP) és l’agent citotòxic utilitzat en la teràpia del CaOV, però genera quimioresistència, l’obstacle més gran per tractar les pacients amb la malaltia recurrent. Les proteïnes de resistència MDR (Multidrug resistant proteins), els processos de reparació NER o Mismatch Repair i les alteracions de la via de p53, són exemples de mecanismes que poden adquirir les cèl•lules tumorals resistents al CDDP.

L'objectiu del present estudi ha estat comprendre els mecanismes de quimioresistència al CDDP del CaOV humà. L'estudi s’ha centrat en la combinació de nous fàrmacs amb el CDDP per sensibilitzar les cèl•lules resistents al CDDP.

Es van establir cultius primaris de CaOV com a model ex vivo per analitzar la resposta als nous tractaments, amb origen tant de tumors sòlids com de líquid ascitic (LASC). La majoria de mostres processades van ser viables, van créixer amb èxit i es van poder congelar per l’ús experimental.

El CDDP és un fàrmac genotòxic que dirigeix a les cèl•lules cap a apoptosi a través de l'activació de la via de p53. Una senyalització defectuosa en aquesta via, compromet la funció de p53, i com a conseqüència el CDDP no indueix apoptosi. Un nou grup de molècules petites no genotòxiques, les Nutlines (Nut3a) han estat desenvolupades per inhibir la unió de p53-Mdm2, induint apoptosi en tumors quimiorresistents a través de l’activació de la via de p53. En el present estudi, Nut3a es va usar per sensibilitzar la línia cel•lular resistent A2780cis al CDDP. Els resultats van mostrar que Nut3a actuava de forma sinèrgica amb el CDDP, induint aturada a la fase G2/M del cicle cel•lular i potenciant la mort cel•lular per apoptosi de la línia resistent A2780cis. A més, la combinació de CDDP+Nut3a també va induir apoptosi i senescència als cultius primaris amb p53 salvatge. Com a conclusió, la Nut3a sensibilitzava a les cèl•lules de CaOV quimiorresistents al CDDP, augmentant l’apoptosi a les línies cel•lulars i als cultius primaris de CaOV. Juntament amb la inducción d’apoptosi es va trobar una disminució del gen Survivina.

Survivina, membre de la família de proteïnes anti-apoptòtiques (IAP) es troba altament expressada en tots tipus de tumors i absent en teixits adults diferenciats normals, i és responsable de la progressió del càncer i resistència a fàrmacs en molts tipus de càncer. L’YM155, és un petit compost que inhibeix selectivament l'expressió del promotor de la Survivina induint apoptosi a cèl•lules tumorals in vitro i in vivo.

Estudis suggereixen que l’YM155 també és un agent que genera dany al DNA. En el present treball, es va determinar l’eficàcia de l’YM155 en combinació amb el CDDP in vitro i in vivo. Els resultats van mostrar que l’YM155 combinat amb el CDDP va intuir aturada en G2/M del cicle cel•lular, apoptosi i augment del dany al DNA a la línia A2780cis, sensibilitzant les cèl•lules al CDDP. De la mateixa manera, la combinació de l’YM155 amb el CDDP va sensibilitzar als cultius primaris de CaOV al CDDP induint també apoptosi i senescència. Treballs in vivo mostren com la combinació de CDDP i YM155 va disminuir significativament la mida tumoral dels xenoinjerts de CaOV, i va ser ben tolerat pels ratolins.

Els nostres resultats suggereixen que les combinacions de Nut3a i/o YM155 amb el CDDP podrien ser una bona opció per la teràpia de CaOV resistent al CDDP, éssent la combinació amb la Nut3a exclusiva pels tumors amb p53 salvatge, i amb l’YM155 independent de l’estat de p53.

Ovarian cancer (OVCa) is the fourth most common gynecological cancer followed by breast, endometrial and cervical cancer, representing the fifth cause of death for cancer in female population. Epithelial OVCa (EOC) represents 90% of all ovarian tumors and is the most lethal, killing approximately 115.000 women annually world-wide. The majority of patients with EOC are diagnosed with advanced disease, and managed with surgical cytoreduction followed by platinum and taxane-based chemotherapy, but the majority of them will eventually suffer from recurrence of disease and death as a consequence of metastasis. Cisplatin (CDDP) is the cytotoxic agent used in OVCa as therapy, but it leads to chemoresistance, the largest obstacle in treating patients with recurrent disease. Multidrug Resistance Proteins (MDR), Mismatch Repair processes and alterations in the p53 pathway are examples of properties within tumor cells that may lead to CDDP resistance.

The aim of the present study has been to understand the mechanisms of human epithelial OVCa chemoresistance to CDDP. The study was focused in the combination of novel drugs with CDDP to sensitize OVCa resistant cells to the chemotherapeutic agent.

OVCa primary cell culture was established as an ex vivo model for analyzing the response to new treatments. Primary cell cultures were obtained from both solid tumors and ascites (LASC). The majorities of samples processed were viable, growth successfully and could be frozen for experimental use.

CDDP is a genotoxic drug that leads cells to apoptosi through the activation of the p53 pathway. Defective signaling in this pathway compromises p53 function, and thus CDDP does not induce apoptosi. A new group of non-genotoxic small molecules called Nutlins (Nut3a) have been developed to inhibit p53-Mdm2 binding, inducing apoptosi in chemoresistant tumors through the activation of the p53 pathway. In the present study, Nut3a was used to sensitize the resistant OVCA cell line A2780cis to CDDP. The results showed that Nut3a synergized with CDDP, inducing cell cycle arrest in G2/M and potentiating apoptotic cell death in the A2780cis resistant cell line. In addition, the combination CDDP+Nut3a also induced apoptosi and senescence in wild type TP53 primary cell cultures. Nut3a sensitized chemoresistant OVCa cells to CDDP, increasing apoptosi both in cell lines and in primary tumor cell lines. Together with the induction of apoptosi, there was a decrease of the Survivin gene.

Survivin, a member of the anti-apoptotic protein family (IAP), is highly expressed in all types of tumor and is missing in normal differentiated adult tissues, and it is responsible for cancer progression and drug resistance in many types of cancer. YM155 is a small chemical compound that selectively suppresses the Survivin promotor, inducing apoptosi in cancer cells both in vitro and in vivo. Studies also suggest that YM155 is a DNA damaging agent. In the present study, the efficacy of YM155 in combination with CDDP was determined both in vitro and in vivo. The results showed that YM155 combined with CDDP induced G2/M cell cycle arrest, apoptosi and increased DNA damage in the A2780cis resistant cell line sensitizing these cells to CDDP. Additionally, YM155 in combination with CDDP sensitized primary cell cultures to CDDP inducing apoptosi and senescence. Studies in vivo show how the CDDP+YM155 combination significantly decreased the tumor size of the OVCa xenografts, being well tolerated by mice.

Our results suggested that the combination of Nut3a and/or YM155 with CDDP could be a good option for the therapy of CDDP resistant OVCa, being the Nut3a combination exclusive for wild type p53 tumors, and YM155 combination independently of p53 status.