Paper de la UGT1A6 en la resistència al metotrexat : estudi dels harpins de polipurines per disminuir l'expressió gènica

Abstract

El treball presentat en aquesta memòria es centra en l'estudi dels mecanismes pels quals el quimioteràpic metotrexat (MTX) desenvolupa resistència en cèl·lules canceroses. Dins d'aquest objectiu es creen dues línies d'estudi que són, trobar nous mecanismes d'inhibició de la dihidrofolat reductasa (DHFR), principal causant de la resistència al MTX, i la troballa de nous gens que puguin estar implicats en aquest procés de resistència.<br/><br/>En el present estudi, hem analitzat la resistència al MTX en cèl·lules de càncer de mama. S'han realitzat microarrays d'expressió amb dues línies cel·lulars sensibles i resistents al MTX, els quals han originat com a únic gen en comú entre les cèl·lules resistents d'ambdues línies la família de les UDP-glucuronosil transferases (UGT1A). Hem estudiat aquesta família de gens, i s'ha identificat la UGT1A6 com la principal responsable de la sobrexpressió de les UGTs a les cèl·lules resistents. En aquest treball s'ha analitzat la implicació de la UGT1A6 en la resistència al MTX. També hem analitzat la inducció transcripcional del MTX sobre la UGT1A6, així com els factors transcripcionals involucrats en aquest procés. A més, s'han estudiat les repercussions terapèutiques que pot tenir la sobrexpressió de la UGT1A6 quan es dóna MTX en combinació amb altres fàrmacs glucuronidables.<br/><br/>Dins de la recerca de nous mètodes per inhibir la DHFR diferents als quimioteràpics clàssics com el MTX, trobem els basats en teràpia gènica. En treballs anteriors del nostre grup s'havien desenvolupat diversos tipus de molècules per disminuir l'expressió de la <i>dhfr</i>, tal com oligonucleòtids antisentit (aODNs), siRNAs i Triplex forming oligonucleotides (TFOs).<br/><br/>En aquest treball hem desenvolupat Template-PPRHs i Coding-PPRHs, hairpins destinats a unir-se a la cadena motlle o codificant del DNA i mRNA, respectivament. Hem estudiat la capacitat citotòxica que tenen els PPRHs en cèl·lules de càncer de mama utilitzant com a model el gen <i>dhfr</i> humà, així com el mecanisme d'acció pel qual aquestes molècules inhibeixen la DHFR. També hem analitzat la capacitat <i>in vitro</i> dels hairpins d'unir-se a la seva seqüència diana i la influència que té la presència d'interrupcions de purines en la cadena de polipirimidines i la forma de minimitzar els seus efectes. Així mateix, hem estudiat l'estabilitat d'aquestes molècules, la seva especificitat i l'activació de la resposta immune. S'ha analitzat l'aplicació terapèutica a partir de l'utilització de PPRHs contra la <i>dhfr</i> en cèl·lules de càncer de mama resistents al MTX, així com el disseny de diferents PPRHs dirigits contra gens amb importància terapèutica en càncer.

<i>The main objective of this work is the study of the mechanisms that lead to resistance to the chemotherapeutic methotrexate (MTX) in cancerous cells. To study this phenomenon there have been two approaches: the search of new strategies to inhibit the expression of the dihydrofolate reductase (DHFR), the main responsible for MTX resistance; and the study of new genes that could be involved in MTX resistance.<br/>A microarrays analysis between two breast cancer cell lines sensitive and methotrexate resistant pointed out the UDP-glucuronosyltransferase 1A (UGT1A) family as a common deregulated node in both cell lines. UGT1A6 was the main isoform responsible for UGT1A family overexpression in these cells and this overexpression was not due to gene amplification. The importance of UGT1A6 overexppression in MTX resistance was studied as well as the induction of UGT1A6 mRNA levels and enzymatic activity carried out by MTX through the transcription factors ARNT (HIF-1) and AhR/ARNT. Cells incubated with anticancer drugs susceptible to glucuronidation together with MTX, showed a lesser degree of cytotoxicity, due to UGT1A6 induction. The pharmacological effect of this induction should be taken into account when combining MTX with other drugs that are glucuronidated.<br/>Polypurine Reverse-Hoogsteen hairpins, PPRHs, are dsDNA molecules formed by two polypurine stretches linked by a pentathymidine loop. These two polypurine domains are bound by intramolecular Reverse-Hoogsteen bonds, allowing the formation of a hairpin structure. PPRHs bind to their targets by Watson-Crick, forming triplex structures. We designed two types of PPRHS: Template-PPRHs and Coding-PPRHs. Template-PPRHs are designed to bind the template DNA strand, whereas Coding-PPRHs target the mRNA and the coding DNA strand. The dhfr gene was selected as a target in breast cancer therapy. Both PPRHs caused a high degree of cytotoxicity and a decrease in DHFR mRNA and protein levels, but through different mechanisms of action. Template-PPRHs decrease mRNA levels since they interfere with the transcription process. Coding-PPRHs interfere with the splicing process by competing with U2AF65 for binding to the polypyrimidine target sequence, leading to a lower amount of mature mRNA. PPRHs can be considered as new molecules to decrease gene expression.</I>