Determinació de l'estructura tridimensional de la glicogen sintasa de

Abstract

Les glicogen i midó sintases són glicosiltransferases que catalitzen la transferència de residus glucosil a l'extrem no reductor d'una cadena creixent d'un glucà &#945;-1,4, retenint la configuració del carboni anomèric del sucre transferit. Aquest procès és central en el metabolisme energètic de la majoria d'èssers vius.<br/><br/>En aquest treball presentem l'estructura cristal·logràfica de la glicogen sintasa de <i>Pyrococcus abyssi</i> (PaGS). Aquest enzim és termoestable i presenta una activitat màxima a 80ºC i és capaç d'utilitzar indistintament ADPG i UDPG com a donadors de glucosil. La PaGS forma de cossos d'inclusió en totes les condicions d'expressió en <i>E.coli</i> assajades. Amb el mètode de renaturalització en columna hem aconseguit que la PaGS es replegui correctament i ens ha permès obtenir la quantitat de proteïna pura necessària per encetar estudis de cristal·lització i de caracterització en solució.<br/><br/>D'altra banda, el domini C-terminal de la PaGS s'expressa de forma soluble i la seva purificació ens ha permès disposar de quantitat suficient de proteïna per a realitzar estudis de cristal·lització. Aquest domini és monomèric tant en solució com en el cristall. La resolució de l'estructura del domini C-terminal a 1.7 Å a partir de reemplaçament molecular utilitzant el domini homòleg de la GS d'<i>Agrobacterium tumefaciens</i> (AtGS) ha permès utilitzar-lo com a model inicial per a resoldre l'estructura de la PaGS a 2.8 Å.<br/><br/>La PaGS és un trímer tant en solució com en el cristall, amb una disposició triangular plana. Cadascuna de les seves subunitats està formada per dos dominis &#945;&#946;&#945; tipus plegament de Rossmann separats per un solc molt profund on es troba el centre catalític de l'enzim. L'estructura global és molt similar a la de la resta d'estructures resoltes del grup GT-B que actuen amb retenció de la configuració anomèrica. La trimerització de la PaGS implica exclusivament els dominis N-terminals de l'enzim, quedant els dominis C-terminals lliures per a poder realitzar la transició d'obertura i tancament necessària per a la catàlisi.<br/>El domini C-teminal conté la cavitat d'unió a nucleòtid, mentre que la majoria d'interaccions amb l'oligosacàrid acceptor es produeixen a través de residus del domini N-terminal. L'elevada similitud del centre actiu entre les GS i les GP suggereix que ambdues operen a través d'un mecanisme catalític similar, si be no idèntic.<br/><br/>L'estructura de la PaGS i la seva comparació amb l'estructura de l'AtGS ofereixen les bases per a entendre l'especificitat de les GS eucariotes per UDPG, com a substrat donador de glucosil, i la promiscuïtat de les GS d'arqueons per unir tant UDPG com ADPG.<br/><br/>La localització d'una molècula de glucosa en la superfície de la PaGS i la comparació amb les GP eucariotes permeten suggerir un possible lloc d'emmagatzematge del glicogen en les GS.