Mecanismo de regulación de NOR-1 en células vasculares: Implicaciones de las LDL y de la vía de síntesis de isoprenoides

Abstract

NOR-1 (<i>Neuron-derived orphan recetor-1</i>) es un receptor nuclear huérfano involucrado en la proliferación y migración de las células musculares lisas (CML) inducidas con suero. En la aterosclerosis es clave la activación de las células vasculares (CML y células endoteliales) por lipoproteínas de baja densidad (LDL) y mitógenos. Los mecanismos moleculares a través de los cuales se produce esta activación se conocen sólo parcialmente. El objetivo de esta tesis es estudiar si NOR-1 está implicado en la activación de las células vasculares inducida por LDL y el factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF), y si la expresión de este gen puede ser regulada por fármacos antiateroscleróticos. Utilizando técnicas de RT-PCR semi- y cuantitativa (PCR en tiempo real) observamos que la expresión de NOR-1 es inducida por LDL en CML y en pared arterial de cerdos hipercolesterolémicos y que los inhibidores de la HMG-CoA reductasa (estatinas) son capaces de inhibir esta inducción. El efecto de las estatinas en las células es revertido por el mevalonato y el geranilgeraniol, pero no por el farnesol. Al inhibir RhoA con simvastatina, exotoxina C3 y toxina B o al inhibir la actividad de Rho Kinase (ROCK, un efector de RhoA) con Y-27632, se inhibe la expresión de NOR-1 inducida por LDL. En el mismo sentido en experimentos de transfección de CML de rata la activación del promotor de NOR-1 inducida por LDL es inhibida por la simvastatina y también al cotransfectar las células con un dominante negativo de RhoA (RhoAT19N). El análisis por Western blot de la proteína de CML inducidas con LDL muestra que un factor de transcripción que regula la actividad del promotor de NOR-1 (CREB) se activa (fosforilación en serina 133), y que dicho efecto es inhibido por simvastatina, exotoxina C3 e Y-27632. También observamos que un promotor formado por cuatro elementos CRE consenso es activado por LDL, efecto que es inhibido al cotransfectar las células con RhoAT19N. Además las LDL son capaces de activar a SMemb, gen regulado por elementos CRE, y la simvastatina de inhibe este efecto. Por otro lado, en estudios con células endoteliales de vena del cordón umbilical humanas (HUVEC), VEGF induce la expresión de NOR-1. La inhibición de la expresión de NOR-1 con oligonucleótidos antisentido dirigidos contra el inicio de traducción de NOR-1, disminuye el efecto proliferativo y migratorio del VEGF en estas células.<br/><br/>Estos resultados muestran que NOR-1 es inducido en CML por LDL a través de un mecanismo dependiente de la activación de CREB y de la vía de RhoA/ROCK. Además NOR-1 participa en la migración y proliferación inducida por VEGF en células endoteliales. NOR-1 podría ser clave en el papel antiaterogénico que desempeñan las estatinas, y podría ser una potencial diana terapéutica para regular la aterosclerosis y la angiogénesis.

<i>NOR-1 is an orphan nuclear receptor involved in VSMC migration and proliferation induced by serum. A key event in atherosclerosis is the activation of vascular cells by LDL and mitogens. The cellular mechanisms through which are produced these processes are known partly. The objective of this work is to study the role of NOR-1 in the activation of vasculars cells by VEGF and LDL activation and the effect of antiatherogenigcs drugs on NOR-1 expression. Simvastatin inhibited NOR-1 expression induced by LDL in VSMC in culture and by hypercholesterolemia in the aorta of hyperlipemic pigs. The inhibition of the isoprenylation of geranylgeranylated proteins by simvastatin was key in both NOR-1 up-regulation and DNA synthesis induced by LDL. Inhibitors of RhoA (toxin B and exotoxin C3) and ROCK (Y-27632) mimicked the effect of simvastatin on NOR-1. Similarly both simvastatin treatment and cells transfected with a RhoA dominant-negative (RhoAT19N) showed inhibition of LDL-induced NOR-1 promoter activity. These effects were associated to the interference of the activation of CREB, a key transcription factor involved in NOR-1 induction. Simvastatin prevented LDL induction of a reporter construct containing four consensus CRE and inhibited the expression of SMemb (a marker for dedifferentiated VSMC) dependent on CREB. In the other hand, VEGF induced an early and transient up-regulation of NOR-1 in human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). NOR-1 up-regulation by VEGF is processed through VEGF receptor-2 (VEGFR-2) and involves different signaling pathways. Antisense oligonucleotides against NOR-1 inhibited VEGF-induced endothelial cell growth and migration.<br/><br/>In conclusion, we identified NOR-1 and CREB as key transcription factors mediating the effect of statins on VSMC proliferation through a mechanism dependent on RhoA/ROCK. Moreover, we have shown that NOR-1 is a key transcription factor regulating endothelial cell growth induced by VEGF. Regulation of NOR-1 could be therapeutic target in atherosclerosis and angiogenesis diseases. </I>