Funció diferencial de les isoformes de l'adenina nucleòtid translocasa en el metabolisme energètic i la proliferació cel.lular. Regulació de l'expressió per PGC-1alfa

Abstract

L’adenina nucleòtid translocasa (ANT) bescanvia l’ATP mitocondrial per l’ADP citosòlic a través de la membrana mitocondrial interna. En humans existeixen 4 isoformes específiques de teixit i desenvolupament. ANT1 es troba a músculo cardíac i esquelètic, i cervell; ANT2 en cèl•lules amb elevada taxa de proliferació; ANT3 és ubiqua i ANT4 en testicles. En ratolins només s’han caracteritzat 3 isoformes: ANT1 i ANT4, homòlogues a les humanes, i ANT2 que és ubiqua. ANT també participa en la regulació de l’apoptosi.

Primerament s’ha estudiat la relació entre l’expressió de les diferents isoformes i el metabolisme associat a l’estat proliferatiu o de diferenciació de diverses línies cel•lulars. En les cèl•lules humanes HeLa, la limitació de la proliferación cel•lular va associada a una disminució del metabolisme glucolític i a una inducció d’ANT3. En el cas de les cèl•lules HepG2 i SGBS, les cèl•lules en confluència també mostren una clara disminució del metabolisme glucolític amb un augment transcripcional d’ANT3 en HepG2 i una disminució d’ANT2 en SGBS. Durant la diferenciació de les cèl•lules de ratolí C2C12, l’expressió d’ANT2 disminueix de forma gradual a l’hora que augmenta la seva capacitat oxidativa. En les cèl•lules HIB-1B, les cèl•lules en confluència també redueixen l’expressió d’ANT2, validant-lo com a marcador de proliferació. L’expressió d’ANT1 en cèl•lules 3T3-L1 disminueix lleugerament en els adipòcits, mentre que ANT2 disminueix a mida que s’atura la proliferació en els preadipòcits, però s’indueix en els adipòcits. En aquest sentit, factors adipogènics com la rosiglitazona o la insulina activen l’expressió d’ANT2 en adipòcits 3T3-L1.

Segonament, la modificació de l’expressió d’una determinada isoforma és suficient per a canviar el fenotip metabòlic de la cèl•lula. En cèl•lules HeLa, el silenciament d’ANT2 redueix el metabolisme glucolític a favor de l’oxidatiu, mentre que el silenciament d’ANT3 comporta una disminució de la proliferació i de l’ATP, i una inducció, independent de ROS, de les citoquines TNF-alfa, IL6 i MCP-1, el que encaixaria amb un fenotip similar al de la senescència cel•lular. Paral•lelament, la sobreexpressió d’ANT2 en cèl•lules HeLa estimula el creixement cel•lular, indueix el metabolisme glucolític i té un efecte protector davant l’apoptosi. En cèl•lules HepG2, la sobreexpressió d’ANT2 també augmenta la proliferació cel•lular i el metabolisme glucolític en detriment de l’oxidatiu. El silenciament d’ANT1 en les cèl•lules de ratolí HIB-1B comporta un augment de l’oxidació de la glucosa, mentre que el silenciament d’ANT2 redueix la proliferació i l’oxidació en favor de la glucòlisi, disminueix l’ATP cel•lular i indueix la resposta inflamatòria independentment de ROS. Aquesta resposta inflamatòria també té lloc en altres tipus cel•lulars, com en els preadipòcits 3T3-L1. La sobreexpressió de la isoforma ANT2 humana en miotubs C2C12 o adipòcits 3T3-L1 també dirigeix les cèl•lules cap a un augment de la glucòlisi, com passa en HeLa o HepG2.

Finalment, s’ha descrit el paper de PGC-1alfa en la coactivació transcripcional dels ANTs. En cèl•lules HeLa, la sobreexpressió de PGC-1alfaprodueix una clara inducció d’ANT1 i ANT2 i, en menor grau, d’ANT3. Aquesta inducció és independent d’mTOR-YY-1, de PPAR-gamma i de PPAR-alfa, però ERR-alfa és imprescindible. En miotubs C2C12, PGC-1alfa indueix l’expressió d’ANT1 i ANT2, amb la participació d’mTOR-YY-1, PPAR-delta o ERR-alfa, però no de PPAR-gamma o PPAR-alfa. Per últim, en adipòcits 3T3-L1 PGC-1alfa també indueix l’expressió d’ANT1 i ANT2, independentment d’mTOR-YY-1 i de PPAR-gamma, però totalment dependent d’ERR-alfa.

En conclusió, la quantitat relativa de les diferents isoformes està estretament lligada a la capacitat proliferativa i al tipus de metabolisme de les cèl•lules, sent l’ANT2 humana la isoforma pròpia de cèl•lules proliferants i glucolítiques, i l’ANT3 humana, o l’ANT2 de ratolí, la de cèl•lules oxidatives/quiescents. A més, el silenciament gènic d’una determinada isoforma o la sobreexpressió de l’ANT2 humana són fets que per si sols poden reconduir el metabolisme de les cèl•lules. Per altra banda, PiGammaJi-1alfa participa de la regulació dels ANTs en diferents línies cel•lulars interaccionant amb ERR-alfa, tot i que també hi poden participar altres factors com YY-1 o PPAR-delta en el cas dels miotubs C2C12.

Adenine nucleotide translocasa (ANT) is the protein responsible for the exchange of the mitochondrial ATP for the cytosolic ADP across the inner mitochondrial membrane. There are several isoforms (4 in humans and 3 in mice) with a specific tissue and developing distribution. Besides this exchanging activity, ANT is also involved in apoptosis regulation and energetic metabolism.

Firstly, we studied the relationship between the expression pattern of the distinct isoforms and the metabolism associated to a particular proliferative or differentiation state. In human cells, proliferation arrest turns in a decrease in glycolytic metabolism, accompanied by an induction of ANT3 expression in HeLa and HepG2 cells or ANT2 mRNA decrease in SGBS cells. During mouse C2C12 cells differentiation, ANT2 expression gradually decreases while oxidative capacity increases. In HIB-1B cells, confluence also reduces ANT2 expression, validating ANT2 as a proliferation marker in these cells. In 3T3-L1 adipocytes, ANT2 mRNA levels diminish in proliferation arrest, but it is induced during adipogenesis. In fact, adipogenic factors such as insulin or rosiglitazone enhance ANT2 expression in adipocytes.

Secondly, modifying the expression of a particular isoform is enough to change the metabolic phenotype of cells. In HeLa cells, ANT2 knockdown reduces glycolytic metabolism whereas ANT3 knockdown reduces proliferation and intracellular ATP levels, and induces TNF-alpha, IL6 and MCP-1 production in a ROSindependent way, promoting a senescence-like phenotype. Furthermore, ANT2 overexpression in HeLa and HepG2 cells induces cell growth and glycolytic metabolism, and it exerts a protective effect against apoptosis in HeLa. ANT1 knockdown in HIB-1B cells leads to an increase in glucose oxidation, while ANT2 knockdown lowers proliferation, oxidative capacity and cellular ATP levels, and induces an inflammatory response. Human ANT2 overexpression in C2C12 myotubes or 3T3-L1 adipocytes also triggers glycolysis induction.

Finally, we have studied the role of PGC-1alpha in the transcriptional regulation of ANT. PGC-1alpha overexpression induces ANT1, ANT2 and ANT3 expression in HeLa cells and ANT1 and ANT2 in C2C12 myotubes and 3T3-L1 adipocytes. This induction is carried out with the interaction with the transcriptional factor ERR-alpha in all cases, although other factors could participate in this regulation depending on the cell line, such as mTOR-YY-1 or PPAR-delta in C2C12 myotubes.

In conclusion, the relative quantity of the different isoforms is closely linked to the cell proliferative capacity and metabolism. Specifically, human ANT2 is the main isoform in proliferative/glycolytic cells, while human ANT3 and mouse ANT2 is the main isoform in quiescent/oxidative cells. Moreover, the specific knockdown or overexpression of one isoform is enough to induce a metabolic shift. On the other hand, PGC-1alpha and ERR-alpha act together in the regulation of ANT expression.