Regulació de les activitats acetiltransferasa i desacetilasa d'histones en resposta a senyals intracel·lulars i extracel·lulars

Abstract

El treball realitzat en aquesta Tesi consisteix en l'anàlisi de diferents mecanismes que participen en la regulació de les activitats HAT i HDAC cel·lulars. Podríem distingir dos tipus de modulació d'aquestes activitats: (1) senyals extracel·lulars- antigen T, (2) senyals intracel·lulars- mitosi. Es coneix que aquests dos processos tenen respostes per part de la cèl·lula a nivell de cromatina. A grans trets, en els capítols 1A i 1B es presenten dos treballs que tenen com a objectiu l'estudi de l'antigen T quan interacciona amb l'acetiltransferasa CBP i la desacetilasa HDAC1. D'altra banda, en el capítol 2 s'ha analitzat l'establiment de diversos patrons de modificacions posttraduccionals de les histones per al manteniment de l'activitat transcripcional dels gens quan la cèl·lula entra a Mitosi. Per últim, en el capítol 3 es presenta un altre tipus de regulació d'aquestes activitats, l'autoacetilació de l'acetiltransferasa PCAF. Així doncs, tres mecanismes diferents per al control d'unes activitats molt importants per la cèl·lula eucariota, que són crucials per al manteniment de l'equilibri acetilació i desacetilació de la cromatina.<br/><br/>1. L'antigen T de SV40 modula les activitats acetiltransferasa i desacetilasa d'histones.<br/><br/>Les acetiltransferases i desacetilases d'histones juguen un paper clau en l'activació de la transcripció gènica, la proliferació i diferenciació cel·lulars modulant l'estructura de la cromatina; no obstant, es coneixen poques coses de la seva pròpia regulació. En el treball que es presenta al capítol 1A, s'ha analitzat la regulació de les activitats acetiltransferasa de cèl·lules CV1 i de cèl·lules CV1COS. A nivell global l'antigen T incrementa l'acetilació de les histones i l'activació de les activitats enzimàtiques que regulen aquesta modificació (HATs) (Figures 1 i 2). L'activitat acetiltransferasa de CBP és superior en les cèl·lules que expressen l'antigen T. D'altra banda, l'existència de la interacció entre l'antigen T i CBP (interacció descrita a la literatura {Avantaggiati, 1996 #39; Eckner, 1996 #24}) modula positivament la capacitat de l'acetiltransferasa d'activar la transcripció gènica del promotor pGal4-Hsp70-luciferasa (Figura 5). <br/><br/>El capítol 1B aborda les conseqüències funcionals de la interacció entre l'antigen T i la desacetilasa d'histones HDAC1. La transcripció del promotor Timidina Quinasa quan és activat pel coactivador CBP, pateix una repressió transcripcional per acció de l'antigen T (Figura 1) com s'havia descrit anteriorment {Avantaggiati, 1996 #39; Eckner, 1996 #24}. Aquesta repressió transcripcional suggereix la presència d'un complex repressor amb activitat desacetilasa. En els experiments de transfeccions transitòries utilitzant TSA s'observa una desrepressió de l'activitat transcripcional d'aquest promotor (Figura 2). Paral·lelament, els nostres resultats demostren que l'antigen T interacciona in vitro amb HDAC1 (Figura 4). En aquest capítol es fa palesa la versatilitat de la proteïna viral, al poder participar en la regulació de dues activitats cel·lulars oposades.<br/><br/>2. Paper de les modificacions de les histones en la senyalització i l'activació dels gens durant Mitosi.<br/><br/>S'havia descrit que durant la mitosi, hi ha una inhibició de la transcripció de forma generalitzada {Prescott, 1962 #390}, tot i així, hi ha alguns promotors que mantenen llocs d'hipersensibilitat a la DNasa I o al KMNO4 {Michelotti, 1997 #414}. Les modificacions post-traduccionals de les histones sorgeixen com a candidates al marcatge dels gens durant la mitosi {Jeppesen, 1997 #360; Kouskouti, 2005 #264}. En l'anàlisi global de les modificacions de les histones relacionades amb l'activació transcripcional: acetilació de H3 (K9, k14) i H4 (K5, K8, K12, K16) o dimetilació i trimetilació de la histona H3K4, es va observar que aquests senyals es mantenen units als cromosomes mitòtics (Figura 1). En l'anàlisi local de tres tipus de gens es va poder observar que tant l'acetilació de H3 i H4 com la metilació de H3K4 eren marques que es mantenien als promotors i gens de GAPDH i Hsp70 (constitutiu i induïble). L'anàlisi del gen de la Ciclina B1, actiu durant mitosi determina que l'activació transcripcional d'aquest gen estava relacionada amb un augment en la di- i la trimetilació de H3K4 (Figura 5).

<I>"REGULATION OF HAT AND HDAC ACTIVITIES IN RESPONSE TO INTRACELLULAR AND EXTRACELLULAR SIGNALS"<br/><br/>Mitosis is a critical phase of the cell cycle: genetic information has to divide and to be transmitted into the daughter cells. Therefore, chromosomes are highly condensed, and the most cellular transcriptional activity becomes repressed.<br/>Histone acetylation is a dynamic process that is regulated by two classes of enzymes, the histone acetyltransferases (HATs) and histone deacetylases (HDACs). These two activities are implicated in remodeling chromatin, so they become very important during mitosis. In the last few years accumulating evidence have shown HATs and HDACs activities as key enzymes on transcriptional activity of genes. These enzymes gain great importance immediately after exit mitosis, when transcriptional activity recovers. What's about these enzymes during mitosis? Do they become inactive? Are they displaced from chromatin or do they remain bound to it?<br/>In this work we have analyzed the global localization, subcellular distribution and activity of these enzymes during mitosis. Finally we have studied the acetylation and methylation levels on promoters and coding regions of selected genes during mitosis. The results show that the basal levels of acetylation are maintained at the promoters during mitosis. </I>