Mitochondrial role of Apoptosis-Inducing Factor (AIF): Oxidative Phosphorylation and Reactive Oxygen Species.

Abstract

The apoptotic function of Apoptosis-inducing factor (AIF) is well documented in the<br/>literature, but its physiological role in the mitochondrion is less certain. Using a small<br/>interfering RNA (siRNA) strategy, we studied whether modulation of AIF expression in<br/>cultured cells influenced the production of reactive oxygen species (ROS). We found<br/>that siAIF-transfected cells had reduced AIF protein levels and this was paralleled by a<br/>significant increase in ROS. We tested the generality of this response by using two<br/>different human cell lines, the hepatoma cell line Hep3B and cervix carcinoma line<br/>HeLa, and also by employing a mouse ES AIF-KO cell line. The increased ROS were<br/>mitochondrial in origin as a similar silencing strategy in cells devoid of a functioning<br/>mitochondrial electron transport chain (ETC) did not result in a ROS-increase. The<br/>augmented ROS levels were sufficient to activate Hypoxia-inducible factor 1&#945; (HIF-1&#945;),<br/>a ROS-sensitive transcription factor, and this effect could be reversed using<br/>antioxidants, both the broad-range general antioxidant (N-acetyl cysteine) and a<br/>specific mitochondrial-targeted antioxidant (MitoQ), proving the implication of ROS in<br/>the HIF-1&#945; stabilization. We also studied another two redox-sensitive transcription<br/>factor and thus observed up-regulation in the expression of Nuclear factor (erythroidderived<br/>2)-like 2 (Nrf2), however without major changes in Nuclear factor-kappa B<br/>(NF-&#954;B) levels. Examination of the cellular oxygen consumption rate revealed that AIFdepleted<br/>cells had a major impairment of respiration, at Complex I in the ETC. Western<br/>blot analysis also showed a loss of Complex I 39 and 20 kDa subunits. Studies using<br/>the antioxidants mentioned above, revealed that the respiratory competence could be<br/>regained in AIF-silenced cells. However, neither of the antioxidant treatments we used<br/>could recover Complex I assembly. Studies of the energetic state of siAIF cells showed<br/>that despite a 30% decrease in the overall intact cell respiration, these cells maintain<br/>normal basal levels of ATP, presumably due to a higher glycolytic capacity and a lower<br/>proliferation rate. Moreover, we analyzed the expression of another redox-active<br/>protein, thioredoxin, by Western blot and found that the mitochondrial isoform, Trx2,<br/>was significantly decreased when AIF was silenced. Preliminary co-immunoprecipitation<br/>analyses and proteomic studies failed to show any direct correlation between AIF and<br/>Trx2 at the protein level.<br/>Our results lead us to the conclusion that the defect in respiration in siAIF cells is<br/>downstream of Complex I protein loss and is presumably due to ROS-mediated<br/>damage to the ETC. This suggests an integral mitochondrial function of AIF, as a redox<br/>modifier and chaperone-like molecule, necessary for Complex I assembly. Additional<br/>studies are required to define the detailed mechanism of the AIF enzymatic activity in<br/>the mitochondrion and to establish its binding partners.

La función proapoptótica del Factor Inductor de Apoptosis (AIF) está bien<br/>documentada, sin embargo su papel fisiológico en la mitocondria es menos conocido.<br/>Empleando la metodología de interferencia por ARN, estudiamos si la modulación de la<br/>expresión proteica de AIF en cultivo celular modifica la producción celular de especies<br/>reactivas de oxígeno (ROS). Observamos que el silenciamiento de AIF estaba seguido<br/>por un incremento significativo en los niveles de las ROS. Estas ROS fueron<br/>mitocondriales de origen, puesto que el silenciamiento de AIF en células que carecen<br/>de la cadena de transporte electrónico funcional (ETC) en la mitocondria no llevó a un<br/>incremento de ROS. Este incremento fue suficiente para activar el Factor inducible por<br/>hipoxia (HIF-1&#945;), efecto que se puede revertir usando los antioxidantes, N-Acetil<br/>Cisteina y MitoQ, demostrando así la implicación de los ROS en la estabilización de<br/>HIF1-&#945;. Los análisis del consumo de oxigeno celular mostraron que las células de AIF<br/>silenciado sufren una disminución en la respiración celular, al nivel del Complejo I de la<br/>ETC, acompañada por una disminución significativa en la expresión de sus subunidades<br/>39 y la 20kDa. Tratamientos con los antioxidantes previamente nombrados mostraron<br/>que la tasa de respiración se puede recuperar, no siendo así con la expresión del<br/>Complejo I de la ETC. Estudios del estado energético de las células siAIF mostraron<br/>que a pesar de la disminución de 30% en la tasa de la respiración celular, estas células<br/>mantienen niveles normales de ATP, como resultado de un incremento en la capacidad<br/>glucolítica y una reducción en la tasa de proliferación. Posteriormente, analizamos la<br/>expresión de la proteína tioredoxina y observamos una disminución significativa en la<br/>isoforma mitocondrial, la tioredoxina 2 (Trx2), aunque los análisis preliminares de coinmunoprecipitación<br/>y proteómica no mostraron la existencia de una correlación<br/>directa entre las proteínas AIF y Trx2.<br/>Concluyendo, nuestros resultados sugieren que el defecto de la respiración celular es<br/>posterior al defecto en el Complejo I, probablemente como consecuencia al daño de la<br/>ETC por ROS. Esta observación apunta a un papel integrador de AIF en la mitocondria,<br/>como modulador del estatus redox y necesario para el ensamblaje del Complejo I.