Borreliosis de Lyme: estudio de posibles vectores ixódidos y evaluación de métodos de diagnóstico microbiológico.

Abstract

Zoonosis causada por bacterias del género Borrelia. por la transmisión<br/>accidental por garrapatas infectadas. El género Borrelia. pertenece a la familia<br/>Spirochateaceae, y son 4 las causales de la borreliosis de Lyme, asociadas en el<br/>complejo Borrelia burgdorferi sensu lato ( B. burgdorferi sensu stricto,B. afzelii, B.<br/>garinii y B. Valaisiana) La adherencia de 48 horas es el mínimo exigido, para la<br/>inoculación de Borrelia burgdorferi sensu lato<br/>Diagnóstico de borreliosis de Lyme: Diagnóstico directo a partir de<br/>diferentes muestras clínicas al observarse fácilmente empleando colorantes<br/>convencionales, Cultivo enmedio de BSK, técnicas de amplificación y la detección<br/>mediante sondas de ADN específico.<br/>En el diagnóstico indirecto se emplean como métodos de referencia, el<br/>enzimoinmunoanálisis como prueba de cribado y la inmunotransferencia para la<br/>confirmación.<br/>Objetivos:<br/>1.- Obtener y caracterizar ixódidos procedentes de distintas áreas de la<br/>provincia de Valencia.<br/>2.- Determinar la presencia de Borrelia burgdorferi sensu lato en los ixódidos<br/>obtenidos.<br/>3.- Seleccionar muestras clínicas con resultado en la prueba de cribado EIA<br/>positivo.<br/>4.- Analizar dichas muestras mediante otras pruebas específicas y<br/>confirmatorias así como evaluar la presencia de reactividad cruzada con otros procesos<br/>nosológicos.<br/>5.- Estudiar las características clínicas y evolución de los pacientes con<br/>marcadores serológicos sugestivos de borreliosis de Lyme así como evaluar su<br/>significación.<br/>Materiales y métodos. Obtención y caracterización de ixódidos, se procedió a<br/>la detección de Borrelia burgdorferi mediante estudio microscopico, cultivo y PCR. La<br/>selección de muestras clínicas, se realizó mediante el método de cribado EIA, y el<br/>estudio de reactividad cruzada y su confirmación mediante pruebas específicas. Y por<br/>último, se realizó el análisis de signos y síntomas clínicos y su relación con las<br/>resultados serológicos. Se realizaron macerados y disecciones a los que se practicó un<br/>estudio microscópico y cultivo en BSK II.<br/>Ya en el 2º periodo, se procedió a la detección de B. Burgdorferi mediante<br/>técnicas de PCR. anidado, utilizando 2 parejas de iniciadores del gen de Osp A, según<br/>el método de Guttman y colaboradores, que permiten obtener en la 2ª amplificación,<br/>un fragmento de 345 pares de bases. Para el gen de la flagelina, utilizamos igualmene<br/>2 parejas de iniciadores del gen de la flagelina, según el método de Lebech y<br/>colaboradores. que permiten obtener en la 2ª amplificación, un fragmento de 275<br/>pares de bases. Para el estudio serológico, se utilizó en primer lugar un método de<br/>cribado EIA IgM-IgG Sistema VIDAS LYT (de bioMèrieux) y un método<br/>complementario IFI Lyme Spot (también de bioMèrieux) que determina anticuerpos de<br/>clase IgM e IgG por separado. Como método confirmatorio, se utilizó la<br/>inmunotransferencia B. burgdorferi cepa B31 (de MarDx Diagnostic) y · B. garinii<br/>genogrupo 2 (de Gull Laboratories). La reactividad serológica cruzada, se llevó a cabo<br/>frente a Treponema pallidum, Coxiella burnetii, Rickettsia conori y Brucella mellitensis,<br/>virus de Epstein-Barr, Citomegalovirus y virus de la inmunodeficiencia humana. La<br/>población de pacientes se correspondió con los atendidos en el área del HGUV<br/>Conclusiones:<br/>1.-La colección e identificación de garrapatas ixódidas procedentes de<br/>diferentes áreas de la provincia de Valencia, ha revelado la existencia de cinco<br/>géneros, con siete especies distintas. Ninguno de ellos, clasificado como Ixodes ricinus,<br/>reconocido principal vector de la borreliosis de Lyme.<br/>2.-En ninguna de las garrapatas estudiadas se ha identificado una espiroqueta<br/>compatible con Borrelia burdorferi sl. u otra especie de Borrelia asociada a un cuadro<br/>de borreliosis de Lyme.<br/>3.-Consideramos que el método más adecuado para el estudio microbiológico<br/>en los ixódidos, es la disección de las garrapatas con extracción de sus estructuras<br/>glandulares e intestinos medios. El uso de ejemplares macerados para detección por<br/>métodos moleculares es desaconsejado por la probable inhibición de la amplificación<br/>del ADN específico.<br/>4.-El método de enzimoinmunoanálisis como prueba de cribado, selecciona una<br/>población de pacientes con características clínicas muy variables, pero también un<br/>grupo de pacientes con manifestaciones características y con una concreta evolución<br/>clínica, que sustentan la existencia de casos probables de borreliosis de Lyme.<br/>5.-La titulación de los anticuerpos específicos de clase IgM e IgG mediante<br/>inmunofluorescencia y los criterios establecidos para la interpretación de las pruebas<br/>confirmatorias de inmunotransferencia con antígenos de B. burgdorferi y B. garinii, se<br/>muestran escasamente rentables en nuestro medio, ya que no permiten confirmar ni<br/>descartar la existencia de la enfermedad en el grupo de pacientes estudiados.<br/>Todo lo cual nos permite considerar la necesidad de un mejor estudio<br/>epidemiológico y clínico de los casos sospechosos de borreliosis de Lyme, y<br/>particularmente el desarrollo de criterios de diagnóstico microbiológico que se adecuen<br/>al perfil de la enfermedad en nuestra área.

Zoonosis caused by bacteria of the genre Borrelia. by the accidental<br/>transmission by infected ticks. The genre Borrelia. concerns to the family<br/>Spirochateaceae, and they are 4 the grounds of Lyme's borreliosis, associated in the<br/>complex broad Borrelia burgdorferi sensu (B. burgdorferi sensu stricto, B. afzelii, B.<br/>garinii and B. Valaisiana) The adherence of 48 hours is the demanded minimum, for<br/>the inoculation of Borrelia burgdorferi sensu lato.<br/>Diagnostic of the Lyme borreliosis: Direcly diasnostic by detection of spirochaeta<br/>with the uses of the clinical specimens (skin biopsies, CSF semple, peripheral blood,<br/>etc.) of patients whith conventional laboratory tintions is relative easy to reconized.<br/>Culture of the organism in BSK medium, molecular characterization of Borrelia isolates<br/>by gene sequences from DNAs amplified (flagellin (flaB), and outer surface protein A<br/>(ospA)) from ticks or patiens confirmed the presence of several Borrelia species.<br/>In the indirect diagnosis use as methods of reference, the<br/>enzimoinmunoanálisis as test of screening and the inmunotransferencia for the<br/>confirmation<br/>Objetivos:<br/>1.- Recolection and caracterization of ixodid ticks from diferent areas of<br/>Valencia countri.<br/>2.- Investigated la presencia de Borrelia burgdorferi sensu lato in these ixode<br/>ticks recolected.,<br/>3.-To select clinical samples with result in the test of screening positive EIA.<br/>4.-To analyze the above mentioned samples by means of other specific and<br/>confirmatory tests(proofs) as well as to evaluate the presence of cross-reactivity with<br/>other processes nosológicos.<br/>5.-To study the clinical characteristics and evolution of the patients with<br/>serologic results suggestive of borreliosis of Lyme as well as to evaluate his<br/>significance.<br/>Materials and methods: Obtaining and characterization of ixodids, one proceeded to<br/>the detection of Borrelia burgdorferi by means of microscopic study, culture and PCR.<br/>The selection of clinical samples, it was realized by means of the method EIA, and the<br/>study of crossed reactivity and his confirmation by means of specific tests. And finally,<br/>there was realized the analysis of signs and clinical symptoms and his relation with<br/>results serológicos. There were realized softened and dissections those who a<br/>microscopic study was practised and culture in BSK II.<br/>In the 2º periode, we made a molecular characterization of B. Burgdorferi from<br/>ticks by gene sequences DNAs amplified (nexteed PCR using 2 primers of gen of outer<br/>surface protein A (OspA), by el Guttman' metode et all that permeted the obtention in<br/>the 2ª amplification, a fragment of 345 pairs of bases. By the flagelina, gene, we<br/>using too 2 pairs of primers of the flagelin gene, by the Lebech metode et al. That<br/>allow to obtain in 2 ª amplification, a fragment of 275 bases pair. For the serologic<br/>study, there was in use first a method of sifted EIA IgM-IgG System VIDAS LYT (of<br/>bioMèrieux) and a complementary method IFI Lyme Spot (also of bioMèrieux) that<br/>determines antibodies of class IgM and IgG separately. As confirmatory method, there<br/>was in use the inmunotransferencia B. burgdorferi B31 (of MarDx Diagnostic) and B.<br/>garinii genogrupo 2 (of Gull Laboratories).<br/>The serologic cross reactivity, whith Treponema pallidum, Coxiella burnetii,<br/>Rickettsia conori and Brucella mellitensis, Epstein-Barr virus, Citomegalovirus virus and<br/>AIDS virus. The population of patients corresponded(fitted) with the attended ones in<br/>the area of the HGUV.<br/>Conclusiones:<br/>1.-The collection and identification of ixodid ticks proceeding from different<br/>areas of the province of Valencia, it has revealed the existence of five genres, with<br/>seven different species. None of them, classified as Ixodes ricinus, recognized principal<br/>vector of Lyme's borreliosis.<br/>3<br/>2.-En none of the studied ticks has been identified an espiroqueta compatible<br/>with Borrelia burdorferi sl. or another Borrelia's species associated with borreliosis of<br/>Lyme disease.<br/>3.-We considered that the method most adapted for the microbiological study in<br/>the ixodid, is the ticks dissection with extraction of its glandular structures and medium<br/>intestines. The use of specimens softened for detection for molecular methods is<br/>dissuaded by the probable inhibition of the amplification of the specific ADN<br/>4.-The enzimoinmunoanálisis method of as screening test, a population of<br/>patients selects with clinical very changeable characteristics, but also a group of<br/>patients with typical manifestations and with a concrete clinical evolution, which they<br/>sustain the existence of probable cases of borreliosis of Lyme.<br/>5.-La qualifications of the specific antibodies of class IgM and IgG by means of<br/>inmunofluorescencia and the criteria established for the interpretation of the<br/>confirmatory tests of inmunotransferencia with B. burgdorferi antigens and B. garinii,<br/>prove to be scantily profitable in our way, since they allow neither confirm nor to<br/>discard the existence of the disease in the group of studied patients.<br/>Allows to consider the need of a better epidemiological and clinical study of the<br/>suspicious cases of borreliosis of Lyme, and particularly the development of criteria of<br/>microbiological diagnosis us that they serve to the profile of the disease in our area.