Modulació de la sensibilitat a la gemcitabina mitjançant estratègies de teràpia gènica en càncer de pàncreas humà.

Abstract

El càncer de pàncreas és la quarta causa de mortalitat en el món industrialitzat. Per tant cal avançar cap a la recerca de noves aproximacions terapèutiques que ens permetin millorar aquest pronòstic. Actualment la gemcitabina és el fàrmac d'elecció, tot i que els resultats són clarament insuficients. En aquest marc s'ha desenvolupat aquest treball amb l'objectiu de millorar els efectes de la gemcitabina emprant estratègies de teràpia gènica en models <i>in vitro</i> i <i>in vivo</i> de càncer de pàncreas humà.<br/><br/>La primera aproximació ha consistit en la reintroducció dels transportadors de nucleòsids hCNT1 i hENT1 mitjançant vectors adenovirals defectius. Els resultats obtinguts ha posat de manifest que la sobrexpressió del transportador de nucleòsids equilibratiu hENT1 mitjançada per adenovirus permet assolir un augment significatiu del transport sensible a NBTI en línies cel·lulars amb un transport basal baix, alhora que indueix un arrest a la fase G2 del cicle cel·lular i redueix l'expressió d'enzims implicats en el metabolisme dels àcids nuclèics. Per altra banda, la combinació terapèutica de la introducció del transportador hENT1 i el fàrmac gemcitabina indueix, sorprenentment, quimioresistència en un model <i>in vitro</i>. Tanmateix, la transferència del transportador in vivo combinada amb el fàrmac afavoreix la inhibició del creixement tumoral. La introducció per infecció adenoviral del transportador hCNT1 provoca un augment del transport sodi-dependent i indueix un arrest a la fase S del cicle cel·lular en cèl·lules tumorals. La sobrexpressió de hCNT1 indueix mort cel·lular per necrosi i inhibeix eficientment el creixement de tumors al teixit subcutani de ratolins atímics. Al mateix temps, la combinació terapèutica amb la gemcitabina provoca una major inhibició del creixement tumoral.<br/><br/>La segona aproximació s'ha basat en la determinació de la implicació de la comunicació intercel·lular en els efectes citotòxics de la gemcitabina. Així com, la modulació d'aquesta citotoxicitat per sobrexpressió de connexina 26 tant <i>in vitro</i> com <i>in vivo.</i> Els resultats obtinguts han mostrat que els nivells de comunicació intercel·lular mitjançats per unions gap determinen l'eficàcia citotòxica de la gemcitabina. Aquesta correlació posa de manifest que la resposta citotòxica a aquest fàrmac pot amplificar-se per efecte adjacent. L'augment de comunicació cel·lular per sobrexpressió de connexina 26 corrobora l'existència d'efecte adjacent in vitro i millora la resposta antitumoral in vivo.<br/><br/>En la tercera aproximació hem unit la teràpia gènica amb p53 amb la replicació viral en el que s'anomena viroteràpia gènica amb la finalitat de potenciar els resultats previs descrits amb aquestes dues estratègies per separat. Per això, s'han generat adenovirus replicatius armats amb el transgèn de p53 i tatp53 sota el control del promotor de fase tardana (MLP) del virus i s'han caracteritzat els seus efectes en models in vitro i in vivo de càncer de pàncreas humà. El conjunt de resultats ha posat de manifest que l'expressió de p53 en la fase tardana de la replicació adenoviral millora l'acció antitumoral de l'adenovirus quan aquest és injectat intratumoralment.<br/><br/>En l'últim bloc s'ha dut a terme l'establiment i estandarització de xenoimplants ortotòpics a partir de tumors subcutanis de cèl·lules tumorals i de nous models ortotòpics procedents directament de fragments quirúrgics d'adenocarcinomes pancreàtics humans amb la finalitat de poder validar diferents combinacions terapèutiques. L'estandarització i caracterització d'aquests models ortotòpics ha evidenciat que les característiques histològiques i genètiques, així com el patró de disseminació metastàtica dels tumors d'origen es mantenen estables al llarg de, com a mínim, 3 generacions.

<i>Pancreatic cancer is the fourth leading cause of mortality in the industrialized world. Therefore, the research of new therapeutic approaches is essential to improve this negative prognosis. Nowadays, gemcitabine is the standard first line treatment drug, even though results are clearly insufficient. In this framework, the aim of this work has been to improve the effects of gemcitabine by means of gene therapy strategies in in vitro and in vivo models of human pancreatic cancer.<br/><br/>The first approach consists of overexpressing nucleoside transporters hCNT1 and hENT1 through defective adenoviral vectors. Overexpression of hENT1 allows a moderate increase on nucleoside transport activity NBTI-sensitive and is associated with cell cycle arrest. Furthermore, therapeutic combination of hENT1 introduction and gemcitabine enhances the inhibition of tumour growth. Introduction of hCNT1 provokes an increase in sodium-dependent transport activity and induces an S-phase cell cycle arrest. hCNT1 overexpression induces necrosis and efficiently inhibit tumour growth. Besides, combination of hCNT1 with gemcitabine enhances the inhibition of tumour growth.<br/><br/>The second approach is based on the analysis of intercellular comunication involvement on gemcitabine cytotoxicity and the modulation by connexin 26 overexpression. Results show that gap junctions determine gemcitabine cytotoxicity. This correlation reveals that cytotoxic response to this drug could be magnified by bystander effect. The increase in cellular comunication by connexin 26 overexpression confirms the existence of bystander effect in vitro and improves antitumoral response in vivo.<br/><br/>In the third approach, p53 gene therapy and viral replication have been joined to perform gene virotherapy. Replicative adenoviruses armed with p53 or tatp53 under the adenoviral major late promoter (MLP) control have been generated. Their effects have been characterized in vitro and in vivo. The results show that later p53 expression in replicative adenovirus improves antitumoral action of adenovirus when is intratumourally injected.<br/><br/>The last point consists of the establishment and characterization of orthotopic xenografts developed from tumour cells and new orthotopic models obtained directly from surgical human pancreatic adenocarcinoma fragments. These orthotopic models retain histologic and genetic characteristics. Dissemination patterns are stable for at least three generations as well. </i>