Cèl·lules mare mesenquimàtiques humanes derivades de teixit adipós per a la teràpia cel·lular. Seguiment

Abstract

L'objectiu d'aquesta tesi doctoral ha estat el d'estudiar el comportament in vivo de les cèl·lules mare mesenquimàtiques derivades de teixit adipós (hAMSC), implantades en animals vius durant períodes extensos de temps, per a determinar la seva funcionalitat com a cèl·lules vehicle per a la teràpia gènica en tumors i per a la reparació de teixits.<br/>Per a dur a terme aquest objectiu es van marcar permanentment les cèl·lules hAMSC amb un vector lentivíric que contenia dos gens traçadors. Per una banda contenia el gen de la proteïna verda fluorescent (GFP) que ens va permetre la selecció de les cèl·lules marcades mitjançant la separació de cèl·lules activada per fluorescència, i per altra, el gen de la luciferasa de Photinus Pyralis (PLuc) que ens va permetre el seguiment no invasiu in vivo mitjançant la bioluminescència no invasiva (BLI). Aquestes cèl·lules, marcades i seleccionades, es van injectar en ratolins immunodeprimits on es van mantenir durant 8 mesos. Durant aquest període de temps, es va observar que aquestes cèl·lules es mantenien estables, que no formaven tumors i que no presentaven desequilibris cromosòmics greus.<br/>Posteriorment vam observar que les cèl·lules hAMSC també podien viure en tumors de pròstata (PC-3), inoculats en els músculs dels ratolins immunodeprimits, durant llargs períodes de temps i mantenir-se de manera estable. La detecció simultània de les cèl·lules tumorals i de les hAMSC va ser possible gràcies al marcatge de les cèl·lules amb diferents luciferases, la PLuc i la luciferasa de Renilla reniformis (RLuc). D'aquí es va concloure que aquestes cèl·lules eren vehicles segurs per a la teràpia cel·lular.<br/>Per portar a terme una teràpia gènica citotòxica en tumors, les cèl·lules hAMSC es van marcar amb un gen suïcida (timidina quinasa), de manera que gràcies a la mort d'aquestes cèl·lules suïcides quan s'administrava la prodroga (Ganciclovir) es produïa un efecte adjacent sobre les cèl·lules veïnes tumorals, fet que provocava la reducció dels tumors fins a un 98,5%. Amb la visualització dels dos tipus cel·lulars va ser possible determinar la dosi necessària de cèl·lules suïcides per obtenir un efecte adjacent major. A més, també es va poder quantificar la modulació del creixement que produïen les cèl·lules hAMSC en diferents tumors injectats de manera ortotòpica.<br/>Paral·lelament, el procediment de la BLI també ens va permetre determinar canvis en l'expressió d'un gen, el col·lagen 2 (COL2A1), el qual té un paper clau durant la condrogènesi: Les cèl·lules hAMSC es van transduir permanentment amb el gen de la PLuc, dirigit a partir del promotor específic del COL2A1, i es va observar una inducció de l'expressió de l'aquesta luciferasa, acompanyada també d'un canvi<br/>fenotípic característic dels condròcits, quan es diferenciaven in vitro al llinatge condrogènic. Per tal de poder fer un seguiment in vivo, no invasiu, aquestes cèl·lules marcades es van transduir també amb la luciferasa RLuc, expressada constitutivament, per tal que fos l'indicador de la proliferació d'aquestes cèl·lules. Les cèl·lules hAMSC doblement marcades i sembrades en matrius d'os desmineralitzat (DBM) implantades subcutàniament en ratolins immunodeprimits van demostrar diferents patrons de diferenciació condrogència d'acord amb els resultats de les anàlisis histològiques. Aquest model, doncs facilitaria el desenvolupament de combinacions entre cèl·lules progenitores i esquelets per a la reparació de teixits.

<i>The aim of this thesis was to study the behaviour of the human mesenchymal stromal cells derived from adipose tissue (hAMSCs) implanted in animals during prolonged time to determine their functionality as vehicles for genetic therapy in tumours and for tissue regeneration.<br/>For this purpose the hAMSCs were labelled by a permanent transduction with lentiviral vectors for the expression of two reporter gens. The green fluorescent protein (GFP) gene which proved to be useful for the enrichment of labelled cells, histological analysis and recovery of cells from tissue implants and the Photinus pyralis luciferase (PLuc) gene which allowed us the long term monitoring with the non-invasive bioluminescence imaging (BLI).<br/>The labelled and selected hAMSCs were injected in immunosupressed mice and maintained during 8 months. During this period, cells maintained a steady state and no detectable chromosomal abnormalities nor tumours formed during the 8 months of residence in the host's tissues.<br/>We also observed that hAMSCs could live long periods when implanted within PC-3 tumours, inoculated in the thighs of immunosupressed mice. The use of two luminescent reporters, allowed the simultaneous and independently monitoring in real time of two different cells populations implanted in the same anatomical site of the animal. Thus, from these observations we conclude that the hAMSCs could be safe vehicles for cell therapy.<br/>In order to perform a citotoxic gene therapy in PC-3 tumours, hAMSCs were labelled with a suicide gene (thymidine kinase). The addition of the prodrug (Gangiclovir) produced the death of these cells and killing of the neighbouring tumour cells (Bystander effect). This bystander effect produced a reduction of the tumours treated with suicide cells of 98.5% comparing with the control ones. The use of BLI and the dual labelling allowed us to optimize the ratio of the suicide vehicles to tumour cells to obtain a major bystander effect. Furthermore it was possible to quantify the tumour growth modulation produced by the injection of hAMSCs within different types of tumour cells.<br/>BLI procedures allowed us to analyze changes in gene expression and monitor cell differentiation in a live animal model of cartilage and bone formation. </i>