Inmovilización de transaminasas y amonio liasas y su aplicación en síntesis de compuestos aminados

Abstract

El objetivo del presente trabajo de tesis es establecer métodos biocatalíticos para la síntesis de los aminoácidos L-fenilalanina, L-aspartato, β−aminobutirato y de las aminas aromáticas 1-feniletilamina y 3-amino-1-fenilbutano, usando biocatalizadores con actividad transaminasa y amonio liasa inmovilizados por técnicas de formación de enlaces covalentes (en el caso de enzimas) y por atrapamiento (tanto para enzimas como para células). Se establecieron dos métodos enzimáticos para la síntesis del aminoácido aromático esencial L-fenilalanina (Phe). El primer método de síntesis se realizó usando como biocatalizador L-aspartato transaminasa (AAT) de corazón porcino inmovilizado. Se optimizaron los métodos de inmovilización de AAT en los soportes Eupergit® C, MANA-agarosa y LentiKats®. Los biocatalizadores inmovilizados resultantes se emplearon en la síntesis de Phe. La inmovilización en Eupergit® C y LentiKats® permitió mejorar la estabilidad del enzima AAT, así como alcanzar rendimientos de reacción de síntesis de Phe superiores al 70%. Además se estableció un método de síntesis multienzimática “one-pot”, para lo que se acoplaron las reacciones catalizadas por los enzimas aspartasa (AspB) y transaminasa (AT). Se determinó la compatibilidad de los enzimas en las condiciones de reacción (pH 7,5 y 37°C) y se establecieron las concentraciones óptimas de los sustratos (0,15 M de fumarato, 0,3 M de NH4Cl y 0,1 M de fenilpiruvato) y de los enzimas (0,3 U de AspB/mL y 2 U de AT/mL). En estas condiciones, se alcanzó un rendimiento global de reacción de 80%. Para la síntesis de L-aspartato (Asp) se utilizó el enzima L-aspartato amonio liasa o aspartasa (AspB) de Bacillus sp. YM55-1 parcialmente purificado. El enzima se inmovilizó en los soportes Eupergit® C, MANA-agarosa y LentiKats®. Los biocatalizadores inmovilizados se emplearon en la síntesis de altas concentraciones de Asp (≥ 60 g/L). Además, el enzima inmovilizado se reutilizó eficientemente en la síntesis del aminoácido, manteniendo alrededor del 90% de su actividad inicial al cabo de 5 ciclos de reacción en todos los casos. La síntesis de las aminas aromáticas 1-feniletilamina (FEA) y 3-amino-1-fenilbutano (AFB) se llevó a cabo utilizando biocatalizadores (células y/o enzima parcialmente purificado) con actividad ω−transaminasa (ω−TA). Se estableció un método de permeabilización de las membranas de células ω−TA utilizando bromuro de cetrimonio (CTAB). Las células ω−TA se inmovilizaron en el soporte LentiKats® con un 100% de retención de su actividad catalítica. El enzima ω−TA se inmovilizó en varios soportes, obteniéndose los mejores resultados en Eupergit® CM y LentiKats®. La inmovilización en LentiKats®, tanto de células (no permeabilizadas y permeabilizadas) como del enzima, permitió la reutilización de los catalizadores hasta en 5 y 10 ciclos de síntesis de AFB, manteniendo alrededor del 80 y 70% de la actividad inicial, respectivamente. Por último, se comprobó que el enzima aspartasa mutado (AspB-C6) a partir de AspB, cataliza la reacción de aminación regioselectiva del ácido crotónico para producir β−aminobutirato. Este enzima se inmovilizó en los soportes Eupergit® C y MANA-agarosa según los métodos de inmovilización establecidos para el enzima AspB en los mismos soportes. Se obtuvieron rendimientos de inmovilización similares pero las actividades retenidas fueron significativamente inferiores para AspB-C6 que para AspB.

The objective of this thesis is to establish biocatalytic methods for the synthesis of the amino acids L-aspartate, L-phenylalanine and β−aminobutyrate, as well as the aromatic amines 1-phenylethylamine and 3-amine-1-phenylbutane, by using biocatalysts with transaminase and ammonia-lyase activity immobilized by covalent attachment techniques (for enzymes) and entrapment (for enzymes and cells). Two methods for the synthesis of the essential aromatic amino acid L-phenylalanine (Phe) were established. The first method was carried out by using L-aspartate transaminase (AAT) from porcine heart as biocatalyst. The immobilization of the enzyme AAT on Eupergit® C, MANA-agarose and LentiKats® supports was optimized, and the three immobilized enzymatic derivatives were used for the synthesis of Phe. AAT immobilized on Eupergit® C and LentiKats® allowed improving the stability of the enzyme as well as reaching reaction yields of Phe over 70%. Moreover, a multi-enzymatic one-pot method for the synthesis of Phe was established by coupling of two consecutive enzymatic reactions catalyzed by aspartase (AspB) and transaminase (AT). The compatibility of both enzymes under the reaction conditions (pH 7,5 and 37°C) was shown; and, the optimum concentration of substrates (0,15 M fumarate, 0,3 M NH4Cl and 0,1 M phenylpyruvate) and enzymes (0,3 U of AspB/mL and 2 U of AT/mL) were established. In these conditions, the global reaction yield was 80%. L-aspartate was synthesized by using the enzyme L-aspartate ammonia-lyase or aspartase (AspB) from Bacillus sp. YM55-1. The enzyme was immobilized on Eupergit® C, MANA-agarose and LentiKats® supports. The immobilized biocatalysts were used for the synthesis of highly concentrated Asp (≥ 60 g/L). Furthermore, the immobilized biocatalysts were efficiently reused in 5 cycles of Asp synthesis, maintaining over 90% of activity and reaching over 90% of conversion in all the cases. The synthesis of the aromatic amine 3-amine-phenylbutane (APB) was carried out by means of cells with ω−transaminase (ω−TA) activity as well as the partially purified enzyme ω−TA. A permeabilization method of the cell membranes with cetrimonium bromide (CTAB) was performed. Cells were immobilized in LentiKats® with 100% retention of the catalytic activity. The enzyme ω−TA was immobilized on several supports, and the best results were obtained with Eupergit® CM and LentiKats® supports. The cells (non-permeabilized and permeabilized) and the enzyme immobilized in LentiKats®, allowed reusing the biocatalysts up to 5 and 10 cycles of synthesis of APB, maintaining around 80 and 70% of the initial activity respectively. Finally, it was shown that the mutated aspartase (AspB-C6) from AspB, catalyzes the regioselective amination of crotonic acid to yield β−aminobutyrate. This enzyme was immobilized on Eupergit® C and MANA-agarose supports, according to the immobilization methods established for AspB on the same supports. The immobilization yields were similar; however the retained activities were lower than those obtained for AspB.