Citopaticitat de la glicoproteïna de l’embolcall del VIH-1. Mecanismes directes i indirectes i implicació en la progressió clínica.

Abstract

La infecció pel VIH-1 es caracteritza per una dràstica davallada en el recompte de cèl·lules T CD4+ que condueix a un estat d’immunodeficiència de l’individu, afavorint l’aparició de manifestacions definitòries de sida com són les infeccions oportunistes. Tot i això, la dinàmica de la pèrdua de cèl·lules T CD4+ no és igual en tots els pacients. En un extrem, hi podem trobar individus en els quals la pèrdua de cèl·lules T CD4+ és accentuadament ràpida, de manera que presenten recomptes de cèl·lules T CD4+ inferiors a les 350 cèl·lules/μl en menys de 3 anys (pacients ràpid progressors, RP). A l’altre extrem hi trobem un grup molt reduït d’individus que mantenen els recomptes de cèl·lules T CD4+ elevats (>400 cèl·lules/μl) i constants tot i presentar una replicació vírica activa a nivells elevats (pacients virèmics no progressors, VNP). La glicoproteïna de l’embolcall víric (Env) representa un dels principals determinants virològics de la citopaticitat del VIH-1, afectant tant les cèl·lules infectades com les no infectades a través de diversos mecanismes directes i indirectes. Per una banda, la unió de gp120 a la molècula CD4 (receptor víric) i a les molècules CXCR4 o CCR5 (coreceptors vírics i determinants del tropisme) així com la capacitat fusogènica de gp41 contribueixen de manera directa a la destrucció de cèl·lules T CD4. Per altra banda, la capacitat de gp41 (a través de l’epítop 3S) d’induir l’expressió a la superfície de les cèl·lules T CD4 del lligand NKp44L contribueix de manera indirecta en la seva destrucció, ja que l’expressió del lligand les sensibilitza per ser destruïdes mitjançant cèl·lules NK activades. Els objectius d’aquesta tesi són, per una banda, el desenvolupament d’un model in vitro per a l’estudi del tropisme i la capacitat fusogènica de l’Env així com la seva relació amb la destrucció de cèl·lules T CD4 per apoptosi i autofàgia i, per altra banda, avaluar la contribució relativa dels diferents mecanismes citopàtics descrits anteriorment en la destrucció de cèl·lules T CD4 in vivo caracteritzant Env aïllades de pacients RP i VNP. En aquest cas, també s’ha avaluat el paper de la resposta humoral anti-Env en els dos grups de pacients. En primer lloc, s’ha desenvolupat un mètode per a l’avaluació in vitro del tropisme i la fusogenicitat de diferents Env cocultivant cèl·lules 293T que expressaven l’Env i cèl·lules TZM-bl com a diana. A més a més, també s’ha demostrat la relació entre la capacitat fusogènica i hemifusogènica de l’Env i la inducció de mort cel·lular tant per apoptosi com per autofàgia. En segon lloc, s’han caracteritzat les Env dels pacients VNP i RP en termes de tropisme, fusió i inducció del lligand NKp44L a la superfície de les cèl·lules T CD4+. En cap cas es van observar diferències significatives que poguessin explicar la diferent dinàmica de pèrdua de cèl·lules T CD4 entre ambdós grups de pacients en relació amb aquests factors virològics. Finalment, s’ha avaluat la resposta humoral anti-Env, analitzant la resposta anti-gp120, la resposta contra l’epítop 3S de gp41 i la resposta humoral neutralitzant. Els resultats van mostrar una major presència d’anticossos contra l’epítop 3S de gp41 i la seva regió juxtaposada en els individus VNP en comparació amb els RP, evitant l’expressió in vivo del lligand NKp44L a la superfície de les cèl·lules T CD4 dels pacients VNP i possiblement contribuint a la seva protecció en aquest grup d’individus. Pel que fa a la resposta humoral neutralitzant, els resultats suggereixen que la seva contribució en el fenotip de VNP és residual ja que va presentar un ventall reduït de poca potència.

La infección por VIH-1 se caracteriza por una drástica caída en el recuento de células T CD4+ que conduce a un estado de inmunodeficiencia del individuo, favoreciendo la aparición de eventos definitorios de sida como son las infecciones oportunistas. Aun así, la dinámica de pérdida de células T CD4+ no es idéntica en todos los pacientes. En un extremo podemos encontrar individuos que presentan una pérdida de células T CD4+ acentuadamente rápida, de modo que, después de la seroconversión, sus recuentos de células T CD4+ llegan a valores inferiores a las 350 células/μl en un período de tiempo inferior a los 3 años (pacientes rápido progresores, RP). En el otro extremo, encontramos un grupo muy reducido de individuos que mantienen los recuentos de células T CD4+ elevados (>400 células/μl) y constantes aunque presentan una replicación viral activa y elevada (pacientes virémicos no progresores, VNP). La glicoproteína de la envuelta viral (Env) representa uno de los principales determinantes virológicos de la citopaticidad del VIH-1, afectando tanto las células infectadas como las no infectadas a través de distintos mecanismos directos e indirectos. Por un lado, la unión de gp120 a la molécula CD4 (receptor viral) y a las moléculas CXCR4 o CCR5 (coreceptores virales y determinantes del tropismo) así como la capacidad fusogénica de gp41 contribuyen directamente a la destrucción de células T CD4+. Por otro lado, la capacidad de gp41 (a través del epítopo 3S) de inducir la expresión en la superficie de las células T CD4+ del ligando NKp44L contribuye indirectamente en su destrucción, ya que la expresión del ligando provoca que las células T CD4+ sean susceptibles de ser destruidas mediante células NK activadas. Los objetivos de esta tesis fueron, por un lado, desarrollar un modelo in vitro para el estudio del tropismo y la capacidad fusogénica de la Env así como su relación con la destrucción de células T CD4 por apoptosis y autofagia y, por otro lado, determinar la contribución relativa de los distintos mecanismos citopáticos descritos anteriormente en la destrucción de células T CD4 in vivo caracterizando Env aisladas de pacientes RP y VNP. Adicionalmente, también se planteó el estudio de la respuesta humoral anti-Env en los pacientes RP y VNP. En primer lugar, se desarrolló un método para la evaluación in vitro del tropismo y la fusogenicidad de distintas Env cocultivando células 293T transfectades con las distintas Env y células TZM-bl como diana. Asimismo, se demostró la relación entre la capacidad fusogénica y hemifusogénica de la Env y la inducción de muerte celular tanto por apoptosis como por autofagia. En segundo lugar, se caracterizaron las Env de los pacientes VNP y RP en términos de tropismo, fusión e inducción del ligando NKp44L en la superficie de las células T CD4+. En ningún caso se obtuvieron diferencias significativas que pudiesen explicar la distinta dinámica de pérdida de células T CD4 observada entre ambos grupos de pacientes en relación con estos factores virológicos. Finalmente, se evaluó la respuesta humoral anti-Env, analizando la respuesta anti-gp120, la respuesta contra el epítopo 3S de gp41 y la respuesta humoral neutralizante. Los resultados mostraron una mayor presencia de anticuerpos dirigidos contra el epítopo 3S de gp41 y su región yuxtapuesta en los individuos VNP en comparación con los RP, evitando la expresión in vivo del ligando NKp44L en la superficie de las células T CD4 de los pacientes VNP y, posiblemente, contribuyendo a su protección en este grupo de individuos. En relación con la respuesta humoral neutralizante, los resultados obtenidos sugirieron que su contribución al fenotipo de VNP es residual ya que presentó un abanico reducido y de baja potencia.

HIV-1 infection is characterized by an important decrease on CD4+ T cell counts, resulting in weakened immune responses that lead to AIDS-defining events such as opportunistic infections. However, the dynamics of the CD4+ T cell loss is highly heterogeneous among HIV-infected individuals. On the one hand, some patients show a markedly fast decay on the CD4+ T cell counts, reaching values lower than 350 CD4 T cell/μl within the first three years after seroconversion (rapid progressors, RP). On the other hand, a really limited group of HIV-infected individuals shows high and maintained CD4+ T cell counts (>400 cells/μl) despite an active and high viral replication (viremic non progressors, VNP). The envelope glycoprotein (Env) represents one of the main virological determinants of HIV-1 cytopaticity, affecting both infected and non-infected cells through direct and indirect mechanisms. By one side, the binding of gp120 to the CD4 molecule (viral receptor) and CXCR4 or CCR5 (viral coreceptors which determine the viral tropism) in combination with the fusogenic capacity of gp41 directly contribute to the destruction of the CD4+ T cells. By the other side, gp41 induces the expression of NK cells ligand NKp44L on the surface of the CD4+ T cells through its 3S epitope, indirectly contributing to its destruction since the expression of the ligand renders these cells highly sensitive to be killed by activated NK cells. The objectives of this thesis were, by one hand, to develop an in vitro method to evaluate the Env tropism and fusogenic ability and its relation with CD4 T cells destruction by apoptosis and autophagy, and, by the other hand, to evaluate the relative contribution of the different cytopatic mechanisms described above in the destruction of CD4+ T cells in vivo, characterizing Env isolated from RP and VNP individuals. Moreover, the role of the humoral immune responses against Env was also evaluated for both groups of HIV-infected individuals. Therefore, a method for the in vitro evaluation of the tropism and the fusogenicity of different Env was developed based on the coculture of Env-transfected 293T cells with TZM-bl as target cells. Furthermore, the relation between the fusogenic and hemifusogenic ability of Env and the induction of cell death by both, apoptosis and autophagy, was demonstrated. Secondly, Env from VNP and RP patients were characterized in terms of tropism, fusion and induction of NKp44L on the surface of primary CD4+ T cells. No significant differences related to those virological factors which could explain the different loss of CD4 T cells between both groups of patients were observed. Finally, the anti-Env humoral response was evaluated, analyzing anti-gp120 response, anti-3S response and the neutralizing humoral response. The results showed a higher presence of antibodies directed against the 3S epitope of gp41 and its juxtaposed region in the VNP individuals compared with the RP. In vivo, this response could avoid the expression of NKp44L on the surface of CD4 T cells from VNP individuals contributing to its protection in this group of patients. Related to the neutralizing humoral response, the results suggested that its contribution to the VNP phenotype was residual, since VNP individuals were unable to mount a broad and potent neutralizing response against HIV-1.