Determinación de la actividad enzimática poli-adp-Ribosa polimerasa en células del sistema inmune

Abstract

Existen numerosas evidencias de que la enzima Poli-ADP-ribosa polimerasa-1 (PARP-1) desempeña un importante papel en la modulación de la expresión génica durante el desarrollo y en respuesta a señales celulares específicas, ejerciendo su acción a diferentes niveles. PARP-1 pertenece a una familia de enzimas (PARP) que, usando NAD+ como sustrato, sintetizan y transfieren homopolímeros de ADP-ribosa en residuos de ácido glutámico en proteínas aceptoras principalmente involucradas en la estabilidad de la cromatina y en el metabolismo del DNA. La actividad de PARP-1, responsable de casi el 90% de la poli-ADP-ribosilación en las células, podría modular la expresión génica a través de la poli-ADP ribosilación de otras proteínas o por asociación física con proteínas relevantes como son los factores de transcripción. <br/><br/>En este trabajo nos hemos centrado en poner a punto un método cuantitativo de medida de la actividad poli-ADP-ribosa polimerasa en células permeabilizadas utilizando 3H-NAD+ como sustrato. Durante su caracterización, el método ha demostrado tener una buena sensibilidad, precisión, especificidad y exactitud. Una vez optimizado, dicho método se ha empleado en el estudio de las reacciones de poli-ADP-ribosilación mediadas por las enzimas PARP en células del sistema inmune.<br/><br/>El estudio de la actividad PARP en timocitos procedentes de ratones deficientes para PARP-1 (Parp-1-/-) y de ratones Parp-2-/- frente a los timocitos procedentes de ratones no modificados genéticamente pone de manifiesto que la actividad de poli-ADP-ribosilación mediada por PARP-2 no sería responsable de la mayor susceptibilidad a apoptosis detectada en los timocitos de los ratones Parp-2-/-, aunque el incremento significativo de la actividad PARP en ausencia de PARP-2 sí que podría, de alguna forma, afectar al fenotipo observado. Dicho incremento de actividad nos sugiere también un efecto de PARP-2 en una posible regulación negativa de la actividad enzimática de PARP-1. <br/><br/>Por otra parte los estudios de estimulación de linfocitos T con PMA+ionomicina y anticuerpos anti-CD3 solos y en combinación con anticuerpos anti-CD28, nos han permitido demostrar la activación de PARP en linfocitos T tras la respuesta a estímulos que no producen daño aparente en el DNA.<br/><br/>Sin duda alguna, la aplicación de la metodología optimizada en este trabajo puede ser de gran ayuda en el campo de la investigación de las reacciones de poli-ADP-ribosilación y a nivel clínico, si finalmente los ensayos clínicos con inhibidores de PARP en diferentes patologías resultan de utilidad clínica.

Several works report the importance of polyADPribose polymerase-1 in genic expression modulation during development and as an answer of specific cellular signals. PARP-1 is the founder member of a family, the PARP family, that synthesize ADP-ribose homopolymers to modify acceptor proteins related to chromatin stability and DNA metabolism. PARP-1 activity , representing 90% of poly-ADP-ribosilation in cells, could be able to modulate genic expression through ribosilation of other proteins, or by interaction with some other proteins as transcription factors.<br/> <br/>The aim of this work was the optimization of a quantitative method for measuring PARP activity in permeabilized cells, using NAD+-H-3 as substrate. During the optimization, the method showed good sensibility, accuracy and specificity. Once optimized, we run the method for measurement of PARP activity in inmune cells.<br/> <br/>The results of PARP activity in thymocytes of Parp-1-/- and Parp-2-/- mice show PARP-2 polyADPribosilation is not the cause of the increased sensibility to apoptosis detected in Parp-2-/- mice, even this increase of PARP activity in ausence of PARP-2 could in some way afect the phenotype observed.<br/> <br/>Stimulation studies of T lymphocytes with PMA+ionomicine and antibobies anti-CD3 and anti CD-28, demonstrated that PARP activation in T lymphocytes does not damage DNA.<br/> <br/>The method developed in this work could be very helpful in polyADPribosilation in the field of basic investigation and in a clinical level, if finally clinical trials with PARP inhibitors show clinical application