Caracterización funcional del factor de transcripción ZmZIM91 de maíz

Abstract

La subunidad reguladora β1 de la proteína quinasa de CK2 de maíz fue usada como anzuelo para realizar un cribado mediante doble híbrido de una librería de cDNA, construida a partir de mRNA de hoja de maíz joven sometida a tres horas de deshidratación. Entre las proteínas que interaccionaron con CK2, fue identificado un factor de transcripción putativo llamado ZmZIM91 (Tipo GATA/Zinc Finger). La proteína ZmZIM91 no había sido anteriormente caracterizada en maíz y la información conocida de sus homólogos en Arabidopsis era muy escasa y no proporcionaban datos acerca de las funciones específicas de este grupo de proteínas. Estudios filogenéticos permitieron demostrar que ZmZIM91 pertenecía a la familia TIFY, más concretamente a la subfamilia ZML, a esta gran familia también pertenecen las proteínas JAZ, las cuales han sido muy estudiadas tanto en Arabidopsis como en otras especies. Con el fin de realizar una caracterización molecular de ZmZIM91, en primer lugar, se estableció que esta proteína era sustrato de la proteína quinasa CK2 de maíz, la cual regula a este factor de transcripción a través de fosforilación tanto bajo tratamientos de sequía como de Metil Jasmonato (MeJA). Por otra parte, fueron llevados a cabo experimentos de pull-down, doble híbrido y complementación Bimolecular, los cuales arrojaron resultados como la interacción de ZmZIM91 con la subunidad reguladora β1 de la proteína quinasa CK2, la dimerización de dicho factor y la interacción con las proteína JAZ, sin embargo se estableció que a diferencia de los JAZ, ZmZIM91 no puede interaccionar con COI1. Por otra parte, se realizaron experimentos de western de hojas de maíz silvestres usando el anticuerpo contra la proteína endógena ZmZIM91 y de sobreexpresión en protoplastos de maíz con aplicación de la hormona MeJA, al igual que MeJA y MG132, donde se observó que ZmZIM91 era degradada en presencia de MeJA a una hora y que su degradación era a través de la vía del proteasoma 26S. Mediante un ensayo de Protein-Array, se logró establecer que ZmZIM91 se podía unir a ADN directamente a través de los motivos GATA y GATC. Ensayos de Inmunoprecipitación de la Cromatina y secuenciación masiva paralela (ChIP-Seq) en planta, permitieron determinar genes diana del factor de transcripción ZmZIM91, siendo dos de ellos el maize caffeic acid O-methyltransferase (COMT) implicado en la biosíntesis de lignina y el gen de la DFR (A1) involucrado en la biosíntesis de los flavonoides, estos resultados fueron confirmados a través de ChIP-QPCR, donde fueron detectados como altamente enriquecidos, además mediante un experimento de expresión transciente en protoplastos de maíz, se pudo determinar que el factor de transcripción ZmZIM91 es un represor de COMT y A1, sugiriendo que ZmZIM91 tiene un papel extendido en la ruta de los fenilpropanoides y que además es un regulador negativo de dicha ruta. Experimentos de inmunoprecipitación de la Cromatina (ChIP) con aplicación de tratamiento con MeJA a una hora, confirmaron que en presencia de esta hormona, ZmZIM91 pierde capacidad de unión a los promotores de COMT y A1. Por otra parte, a través de ensayos de complementación Bimolecular se estableció la interacción del factor de transcripción ZmZIM91 con los factores ZmMYB31 y ZmMYB42 implicados en la regulación negativa de genes de la ruta de los fenilpropanoides, con los cuales podría estar actuando como un módulo regulador sobre promotores de genes como ZmCOMT y ZmA1.

The regulatory subunit of protein kinase CK2β1 was used as a bait to perform a yeast two-hybrid screening against a cDNA library of drought-stressed maize leaves. Between the interacting partners a putative transcription factor named ZmZIM91 (GATA/Zinc Finger type) was identified. The protein ZmZIM91 has not been previously characterized in maize and there was little information about their homologous in Arabidopsis thus, no fuctional data regarding this group of proteins was available. Sequence analysis and phylogenetic studies show that ZmZIM91 belong to the TIFY family, more specifically at the ZML subfamily. JAZ proteins, which have been widely characterized in Arabidopsis and in other species, also belong to the TIFY family.

To make a molecular characterization of ZmZIM91, first of all, it was demonstrated that this protein was an in vitro substrate of the maize protein kinase CK2. In addition, in vivo gel kinase assays suggest that phosphorylation regulates this protein under different treatments as drought or methyl jasmonate (MeJA). Furthermore, were carried out a set of experiments as pull-down, yeast two-hybrid assay and Bimolecular fluorescence complementation, which yielded results as the interaction between ZmZIM91 with the regulatory subunits of the protein kinase ZmCK2, the dimerization of ZmZIM91 and the interaction with JAZ protein, however, it was established that unlike JAZ, ZmZIM91 cannot interact with the E3 ubiquitin ligase COI1. Furthermore, were performed western blot experiments using wild-type maize leaves and the endogenous antibody against ZmZIM91 (produced in this work), also assays of overexpression in maize protoplasts in both using the MeJA hormone, as MeJA and MG132, where it was observed that ZmZIM91 was degraded in the presence of MeJA in one hour and its degradation it is probably through the 26S proteasome pathway. Using a Protein-Array assay, it was established that ZmZIM91 could bind to DNA directly through GATA and GATC motifs. Finally, experiments of chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing (ChIP-Seq), allowed to determine target genes of the transcription factor ZmZIM91. Between the targets identified, one correspond to the caffeic acid O-methyltransferase (COMT) gene, involved in the biosynthesis of lignin and another is the DFR gene (A1) involved in the biosynthesis of flavonoids. These results were confirmed by ChIP-QPCR, and by transient expression experiments in maize protoplasts where they were identified as highly enriched, It was determined that the ZmZIM91 transcription factor is a repressor of COMT and A1 genes, suggesting a regulatory role of ZmZIM91 in the phenylpropanoid pathway and also as a negative regulator of this pathway. Experiments Chromatin immunoprecipitation (ChIP) with MeJA treatment application at one hour, confirmed that in the presence of this hormone ZmZIM91 loses binding capacity to the COMT and A1 promoters. Moreover, through Bimolecular complementation assays was established the interaction between the transcription factor ZmZIM91 and the ZmMYB31 and ZmMYB42 factors involved in the negative regulation of genes of the phenylpropanoid pathway, which may be acting as a regulatory module to regulate genes such as COMT.