Estudio de la regulación del metabolismo hidrocarbonado durante la regeneración hepática

Abstract

Durante la regeneración hepática el contenido de fructosa 2,6-bisfosfato, Fru-2,6-P(2) disminuyó rápidamente (1 h) manteniéndose los niveles bajos durante las primeras 24 h. A partir de este tiempo, los niveles tendieron a recuperarse sin alcanzar los valores control a los 7 días. El contenido de glucógeno mostró un perfil similar siendo la disminución inicial menos rápida (mínimo a las 6 h) y restableciéndose el contenido a los 7 días. Los bajos niveles de Fru-2,6-P(2) después de una hepatectomía parcial correlacionan con el incremento de la gluconeogénesis y la disminución de la glucolisis descritos. Posiblemente la causa de la rápida disminución del contenido de Fru-2,6-P(2) después de una hepatectomía parcial sea la fosforilación del enzima por la proteína quinasa dependiente de cAMP como así lo sugiere la rápida disminución de la actividad PFK-2 activa (que representa la actividad quinasa de la forma no fosforilada del enzima bifuncional 6-fosfofmcto 2-quinasa/fructosa 2,6-bisfosfatasa, PFK-2/FB/Pasa-2) y del cociente de actividades PFK-2 activa/total (reflejo del grado de fosforilación del enzima bifuncional). Otros factores como la disminución del contenido de hexosas 6-fosfato y el aumento de citrato y fosfoenolpiruvato podrían también contribuir al mantenimiento de estos bajos niveles.<br/><br/>Durante el proceso regenerativo aparece una forma del enzima bifuncional diferente a la del enzima de hígado adulto como lo indica su comportamiento cinético frente al glicerol 3-fosfato y a la incubación con la proteína quinasa dependiente de cAMP. El diferente reconocimiento de esta forma enzimática con anticuerpos específicos de la PFK-2/FBPasa-2 de hígado y con anticuerpos contra toda la proteína sugiere que tiene su extremo amino modificado. Durante todo el proceso proliferativo el ARNm que se expresa es específico de hígado por lo que la modificación del extremo amino no es debida a un alternativo "splicing" del gen sino a alguna modificación post-transcripcional aún no descrita para este enzima.<br/><br/>Los niveles de ARNm del enzima bifuncional disminuyeron rápidamente después de una hepatectomía parcial con un mínimo a las 6 h y aumentando después de este tiempo con un máximo a las 48-60 h, y tendiendo a normalizarse después de este tiempo. Estos niveles de ARNm estuvieron regulados a nivel transcripcional, no correlacionando las variaciones del contenido de ARNm con variaciones en el contenido del enzima. La velocidad de degradación del ARNm del enzima bifuncional no se modificó durante las primeras horas después de una hepatectomía parcial sugiriendo un papel mis importante de la regulación transcripcional durante esta fase.<br/><br/>Los niveles de ARNm de los enzimas considerados reguladores de la glucolisis/gluconeogénesis: glucoquinasa (GK), piruvato quinasa (L-PK), fructosa 1,6-bisfosfatasa (FBPasa-1) y fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (PEPCK) fueron analizados por "Northern blot". En general, durante la fase pre-replicativa (0-12 h) se observa una disminución del contenido de ARNnl de los enzimas glucolíticos y aumento del de PEPCK. Esta correlación se rompe durante la fase replicativa (>12 h) donde se aprecia la recuperación del mensajero de GK (24 h), junto con elevados niveles de PFK-2FBPasa-2 y PEPCK. El contenido del mensajero de la LPK se recuperó a los 7 días, mientras que los niveles de FBPasa-1 no se modificaron significativamente durante todo el proceso regenerativo. El contenido de ARNm de estos enzimas también fue analizado en los animales laparotomizados y, aunque mostraron algunas modificaciones, éstas fueron mucho menos pronunciadas que en los animales hepatectomizados, normalizándose alrededor de las 24 h.<br/><br/>La administración de glucagón intraperitonealmente (1 mg/kg) produjo sobre el sistema de la Fru-2,6-P(2) (metabolito, enzima, mensajero) una situación similar a la detectada durante las primeras horas después de una hepatectomía parcial. Así se observó una disminución del contenido de Fru-2,6-P2 en paralelo a la fosforilación del enzima. La actividad PFK-2 total y el contenido de ARNm también disminuyeron. Los niveles de ARNm estuvieron regulados a nivel transcripcional observándose una disminución de la velocidad de transcripción del gen en paralelo al contenido del ARNm. Sorprendentemente, la estabilidad del ARNm del enzima bifuncional aumentó en presencia de glucagón sugiriendo que quizás las vidas medias de los<br/>ARNm estimadas mediante este procedimiento "in vitro" no reflejen las vidas medias reales "in vivo". Esta estabilización de los niveles de ARNm en presencia de glucagón también ocurrió para la L-PK y la PEPCK. La estabilización de los ARNm se modificó en presencia de cicloheximida, un inhibidor de la síntesis de proteínas, sugiriendo todos estos datos que en la estabilización de estos ARNm están involucradas proteínas con un recambio rápido y reguladas por un proceso dependiente de cAMP.

<i>Glycogen and fmclose 2,6-bisphosphate levels in rat liver decreased quickiy after partial hepateciomy. After 7 days the glycogen level was normalyzed and fructose 2.6-bisphosphate concentration still remained low. The active (non-phosphorylaied) fonn of 6-phosphofructo-2-kinase/fructose 2,6-bisphosphatase (PFK-2/FBPase-2) varied in parallel with fructose 2.6- bisphosphate levels. The mRNA of PFK-2/FBPase-2 expressed during the hepatic regeneration is the adult liver form. The kinetic and immunological differences found for PFK-2/FBPase-2 during liver regeneration could reflect some as yet unidentified post-translational change.<br/><br/>The mRNA levels of glucokinase (GK), L-pyruvate kinase (L-PK), PFK-2EBPase-2, fructose 1,6-bisphosphatase (FBPase-1) and phosphoenolpyurvate carboxykinase (PEFCK) were analyzed during liver regenerartion. The mRNA levels of glycolytic enzymes (GK, PFK-2/FBPase-2 and L-PK) decreased rapidly after partial hepatectomy. GK mRNA increased at 16-24 h, returning to normal values after his time. After six hours the PFK-2/FBPase-2 mRNA increased to a maximum at 48 hours, and returned to normal levels by 96 hours. L-pyruvate kinase mRNA recovered control levels al 168 h. In contrast, phosphoenolpyruvate carboxykinase mRNA increased rapidly after liver resection and remained high during the regenerative process. However, the levels of fructose 1,6-bisphosphatase mRNA, another gluconeogenic enzyme, were not modified significantly. These results correlate with reported rates and enzyme levels of increased gluconeogenesis after partial hepatectomy. The effect of stress on the mRNA levels was also studied. All enzymes showed variations in their mRNA levels following the surgical stress. The differences were more pronounced in regenerating than in sham animals, being practically normalized at 24 h. The rate of gene transcription of PEFCK, PFK-2/FBPase-2 and albumin was measured during liver regeneration. The transcription rate of albumin did not change whereas that of PEPCK was increased >12-fold at 6 hours and remained high during the regenerative process. The rate of gene transcription of PFK-2FBPase-2 decreased by 50 % at 6 hours and increased thereafter with a maximum at 72 hours, and then returned to control values at 96 hours. These results correlate with the mRNA levels and demonstrate that gene inscription of PEFCK and PFK-2FBPase-2 is specifically regulated, and that this regulation is in part responsible for the alterations in hepatic metabolism seen in regenerating liver.<br/><br/>The administration of glucagon reproduced in fructose 2.6-bisphosphate system (meitabolite, protein, mRNA) a similar situation that we have described during the first hours after partial hepatectomy. </i>