Purificació i caracterització de dos proteïnes inhibidores termoestables de l'activitat HMG-CoA reductasa fosfatasa de fetge de rata

Abstract

La síntesi de colesterol es veu regulada principalment per l'enzim 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzim A reductasa o HMG-CoA reductasa. L'HMG-CoA reductasa està sotmesa a nombrosos mecanismes que li'n regulen tant la quantitat com l'activitat. Aquests mecanismes es classifiquen en dos grups, els que actuen a llarg plaç regulant fonamentalment la quantitat de l'enzim i actuant a nivell de la síntesi i degradació d'aquest, i els que actuen a curt plaç controlant-ne l'activitat. El segon tipus de regulació a curt plaç es du a terme principalment a través d'un mecanisme de fosforilació i desfosforilació reversible.<br/><br/>En l'esquema de regulació de l'HMG-CoA reductasa de molts altres sistemes interconvertibles per fosforilació, cada proteïna fosfatases en la regulació del sistema subjecte a vegada més, es dona una major importància al paper de les <br/>proteïna fosfatases en la regulación del sistema subjecte a interconversió. Aquest fet condueix al plantejament de l'existència d'altres proteïnes, com ho són les proteïnes inhibidores que regulen, a la vegada, l'actuació de les proteïna fosfatases.<br/><br/>L'objectiu principal d'aquesta Memòria fou, per tant, aprofundir en el conêixement del control del procés d'activació per fosforilació covalent de l'HMG-CoA reductasa, mitjançant l'estudi dels Inhibidors de proteïna fosfatases.<br/><br/>Des de l'any 1976, es coneix l'existència de dues proteïnes Inhibidores de fosfatasa tipus 1, l'inhibidor 1 i l'inhibidor 2. Tots aquests estudis han estat realitzats fonamentalment sobre el sistema fosforilasa fosfatasa, per tant ens plantejarem fer un estudi d'aquests inhibidors en el sistema reductasa fosfatasa ja que l'HMG-CoA reductasa és també un enzim regulable per un procés de fosforilació reversible.<br/><br/>EIs resultats obtinguts d'aquest estudi demostren l'existència de dos inhibidors de proteïna fosfatases emprant HMG-CoA reductasa com a substrat. El primer d'ells, que inhibeix l'activitat reductasa fosfatasa de la fosfatasa tipus 1, ha estat purificat a homogeneïtat a partir de citosol de fetge de rata. Aquest inhibidor te un pes molecular aparent d3 45 Kd determinat per filtració molecular en gel de 31 Kd determinat per electroforesi en gel d'acrilamida-SOS.<br/><br/>L'estudl previ de la distrlbució subcel.lular d'aquest inhibidor de la fosfatasa tipus 1 i substrat HMG-CoA reductasa mostrà que el 90% de l'activitat inhibitòria total està localitzada en la fracció citosòlica. Aquest inhibidor presenta una gran reSsistència al calor i a tractaments àcids, a la vegada que mostra una gran sensibilitat a la tripsina i a l'etanol. <br/><br/>L'inhibidor de la fosfatasa 1 inhibeix a la fosfatasa de tipus 1 a concentracions nanomolars, mentre que inhibeix a la fosfatasa 2A a concentracions micromolars, tant si el substrat emprat és I'HMG-CoA reductasa com si es tracta de la glicogen fosforilasa. Aquest comportament cinètic és similar al que presenta l'inhibidor-2 de múscul esquelètic de conill.<br/><br/>L'inhibidor de la fosfatasa 1 és capaç de formar complexes inactius d'alt pes molecular de fosfatasa tipus 1. Aquests complexes són reactivables quan se'ls incuba en presència de GSK-3 i ATP-Mg. <br/><br/>Aquest inhibidor és fosforilable per acció de la proteïna quinasa dependent d'AMP cíclic i [gamma-(32)P]ATP i Mg(2)+ i per l'acció de la GSK-3 i [gamma-(32)P]ATP i Mg(2)+.<br/><br/>L'anàlisi del conjunt de resultats indica l'existència d'una gran similitud en el comportament cromatogràfic, electroforètic, cinètic, etc. entre l'inhibidor de la fosfatasa 1 I l'inhibldor-2 ja descrit de múscul esquelètic de conill, i ens permet afirmar que ambdos inhibidors són similars.<br/><br/>El segon inhibidor purificat a homogenertat a partir de fetge de rata inhibeix l'activitat reductasa fosfatasa de la fosfatasa tipus 2A i presenta un pes molecular aparent de 30 Kd quan es determina per filtració en gel i de 20 Kd quan es determina per electroforesi en gel d'acrilamida-SDS.<br/><br/>L'activitat inhibitòria sobre la fosfatasa tipus 2A està localitzada en la fracció citosòlica i presenta també una gran resistència al calor i a tractaments àcids, a la vegada que mostra una gran sensibilitat a la tripsina i a l'etanol.<br/><br/>Aquest inhibidor inhibeix la fosfatasa 2A a concentracions nanomolars, mentre que no inhibeix la fosfatasa de tipus 1, quan el substrat emprat és l'HMG-CoA reductasa. Si el substrat és la glicogen fosforilasa cap d'ambdues activitats fosfatàsiques es veuen inhibides.<br/><br/>L'inhibidor da la fosfatasa tipus 2A no és fosforilable ní per GSK-3 ni per la quinasa dependent d'AMP cíclic. L'anàiisi del conjunt de resultats indica que l'inhibidor de la fosfatasa 2A és un inhibidor especlfic de l'activitat reductasa fosfatasa no descrit fins ara.

<i>A protein inhibitor of HMG-CoA reductase phosphatise 1 activity was purified to homogeneity from rat liver. The purified protein has a molecular mass of 31 kDa. This spontaneously active protein is thermostable and acid resistant. The protein inhibitor is phosphorylated by glycogen synthase kinase-3 and cAMP-dependent protein kinase without change in its inhibitory activity. The inhibition caused by this inhibitor on phosphatase and 2A is similar to that of inhibitor-2 from rabbit skeletal muscle using hydroxymethylglutaryl-CoA reductase as substrate.<br/><br/>Another heat-stable protein inhibitor of the hydroxymethylt-glutaryl CoA reductase phosphatase 2A activity has been identified and purified to homogeneity. The apparent molecular mass was 20,000 Da. The protein lost its inhibitory properties when incubated with trypsin or treated with ethanol. The inhibitor protein does not inhibit type 1 phosphatase when either phosphorylase or hydroxymethylglutaryl-CoA reductase is the substrate but not when phosphorylase A is the substrate. In contrast, this protein inhibitor inhibits the rat liver type 2A phosphatase activity when hydroxymethyl-glutaryl-CoA reductase activity but also by the absence of (32)p release from (32)p- labeled hydroxymethylglutaryl-CoA reductase. The inhibition on the phosphatase activity is shown not only by the modified hydroxymethyl-glutaryl-CoA reductase. The inhibitor protein is not activated by incubation with ATP and cAMP-dependent protein kinase and it is not phosphorylated by glycogen synthase kinase-3. These results, together with those of the kinetic experiments, suggest that the reductase phosphatise inhibitor is distinct from protein phosphatase inhibitor-1 and inhibitor-2. </i>