Avian Influenza Infection Dynamics in Minor Avian Species

Abstract

Amb la fi de comprendre la dinàmica de la infecció pel VIA en aquestes tres espècies aviàries no convencionals, així com la funció epidemiològica que exercirien en un brot interespècie d’IA per tal de definir millors estratègies de vigilància, es van realitzar tres infeccions experimentals, les quals s’han descrit en aquesta tesi. La patogènia de la infecció tant pel VIAAP com pel VIABP es va determinar per a la perdiu roja (Estudi I), la guatlla europea (Estudi II) i el falcó híbrid sacre‐grifó (Estudi III), posant especial èmfasi en la descripció de la malaltia clínica, les lesions macroscòpiques i microscòpiques, i la presència de l’antigen víric als teixits. A més, en aquest treball s’ha descrit el patró d’excreció vírica de cada espècie aviària i cada VIA, i s’ha avaluat la probabilitat d’una eficaç transmissió vírica entre animals. L’Estudi II també representa un estudi comparatiu de la dinàmica d’infecció en dos subtipus diferents de VIABP (H7 i H5). En el cas dels Estudis I i II, es va prestar especial atenció en les plomes com a possible origen de propagació del VIA. A més, a l’Estudi II es va investigar l’aigua com a possible ruta de transmissió. Finalment, a l’Estudi III es va reproduir amb eficiència la infecció natural pel VIA en falcons (és a dir, mitjançant la ingestió de preses infectades) i es va dilucidar per primera vegada en aquesta espècie el patró dels receptors del virus de la grip. A l’Estudi I, les perdius roges infectades pel VIAAP van presentar els primers signes clínics a 3 dies post‐inoculació (dpi); a partir de 4 dpi van començar a morir i a 8 dpi ja no restava cap espècimen viu. Per mitjà d’immunohistoquímica (IHQ) i de PCR quantitativa a temps real (PCRq‐TR), es va confirmar la presència de l’antigen víric en teixits i l’excreció del virus, respectivament, tant en perdius inoculades amb el VIAAP com contactes. No es van observar ni signes clínics ni troballes histopatològiques a les perdius infectades pel VIABP. A més, a algunes perdius inoculades amb el VIABP, només es va detectar l’excreció del virus a curt termini, juntament amb seroconversió. L’Estudi I va posar de manifest que la perdiu roja presenta una elevada susceptibilitat a la soca del VIAAP H7N1 que es va utilitzar, la qual va causar greu malaltia clínica, alta mortalitat i excreció vírica abundant. Per consegüent, aquesta au podria contribuir a la propagació d’un possible brot local del virus. En canvi, els resultats que es van observar pel VIABP H7N9 indicarien que la perdiu roja no és un reservori d’aquest virus. A l’Estudi II, es van observar greus signes neurològics i una taxa de mortalitat del 67 % (H7N1/AP) i del 92 % (H5N1/AP) a les guatlles europees infectades pel VIAAP. Tot i que van aparèixer troballes histopatològiques en ambdós grups infectats pel VIAAP, les guatlles infectades amb VIAAP H5N1 van mostrar una distribució d’antigen víric més àmplia i lesions microscòpiques més intenses. No es va observar afectació clínica o patològica a les guatlles infectades pel VIABP. Pels tres VIA investigats es va demostrar una excreció vírica consistent i de llarg termini i una transmissió efectiva a les guatlles susceptibles. L’aigua va sorgir com a possible ruta de transmissió, i les plomes com a possible font de propagació de VIAAP. L’Estudi II posa en relleu que la guatlla europea pot tenir una funció important en l’epidemiologia de la IA, la qual cosa fa ressaltar la necessitat de conèixer amb més profunditat la seva possible funció com a hoste intermediari en el cas dels virus recombinants d’aus/mamífers. A l’Estudi III, els falcons van mostrar una dinàmica d’infecció similar tot i les diferents rutes d’exposició (és a dir, ruta nasocoanal o a partir de la ingestió de preses infectades), fet que va demostrar l’efectivitat de la ruta d’alimentació in vivo. Els falcons infectats pel VIAAP H5N1 mostraven greus signes neurològics aguts i van morir, o van ser sacrificats, entre 5 i 7 dpi. Mitjançant IHQ i RRT‐PCR es va confirmar la presència de l’antigen víric a diferents teixits. Aquest antigen s’associava normalment a lesions microscòpiques, sobretot a l’encèfal. No es van observar ni signes clínics ni lesions histopatològiques a cap dels falcons infectats pel VIABP H7N2, encara que tots els espècimens havien seroconvertit a 11 dpi. Es va detectar forta presència de receptors aviaris al tracte respiratori superior dels falcons, en concordança amb l’excreció vírica detectada per RRT‐PCR tant als falcons infectats per VIABP com per VIABP. L’Estudi III mostra que falcó híbrid sacre‐grifó presenta elevada susceptibilitat a la infecció pel VIAAP H5N1, tal com s’havia observat prèviament, i que podria jugar un paper rellevant en la propagació tant de VIAAP com de VIABP. Per primera vegada en el cas dels rapinyaries, es va reproduir amb èxit la infecció natural a partir de la ingestió de preses infectades. L’ús d’aus de presa a la falconeria i a centres de recuperació de fauna podria posar en risc rapinyaires de gran valor i humans i, per tant, seria convenient realitzar un seguiment intensiu d’aquesta pràctica. La present tesi posa en relleu la importància d’estudiar la susceptibilitat, la dinàmica d’infecció i la probabilitat de transmissió del VIA en hostes aviaris de la interfície domèstic‐salvatge. Adquirir aquest coneixement és vital per realitzar tasques de vigilància eficaces, desenvolupar mesures preventives adequades i gestionar amb èxit els brots d’IA quan es veuen afectades diferents espècies aviàries.

Avian influenza (AI) has become one of the most important challenges that ever emerged from animal reservoirs. The constant outbreaks detected worldwide in domestic and wild bird species are of concern to the economics of the poultry industry, wildlife conservation, and animal and public health. Susceptibility to AI viruses (AIVs) varies deeply among avian species, as well as their possible role as sentinels, intermediate hosts or reservoirs. To date, several experimental studies and natural infections have assessed the susceptibility of numerous major and minor avian species to diverse highly (HPAIV) and low (LPAIV) pathogenic AIVs. Gallinaceous poultry are considered to be highly susceptible, whereas waterfowl have long been recognized as natural reservoirs. However, scarce information concerning the infection dynamics of AIV in the red‐legged partridge (Alectoris rufa), European quail (Coturnix c. coturnix), and gyr‐saker hybrid falcon (Falco rusticolus x F. cherrug) exist so far. Such non‐conventional avian species may be of great interest in particular geographical regions, including the Iberian Peninsula. These species not only belong to the autochthonous wildlife, but they are also raised (normally within extensive farming systems) for various human benefits, which leads to close contact with both humans and local wildlife. With the aim to understand the dynamics of AIV infection in these three non‐conventional avian species, and their epidemiological role in an interspecies AI outbreak to better define surveillance strategies, three experimental infections were undertaken which have been presented in this dissertation. The pathogenesis of the infection with both LPAIV and HPAIV was determined in the red‐legged partridge (Study I), European quail (Study II), and gyr‐saker hybrid falcon (Study III), with special emphasis on describing the clinical disease, gross and microscopic lesions, together with the presence of viral antigen in tissues. In addition, viral shedding pattern for each avian species and each AIV was defined, and the likelihood of effective viral transmission among birds was assessed. Study II also represents a comparative study of infection dynamics of two different HPAIV subtypes (H7 and H5). In Studies I and II, special attention was paid on feathers as a potential origin of AIV dissemination. Besides, in Study II drinking water was investigated as for being a possible transmission route. Finally, in Study III, the natural AIV infection route in falcons (i.e., by ingestion of infected prey) was efficiently reproduced, and the influenza virus receptors’ pattern in this species was elucidated for the first time. In Study I, HPAIV‐infected red‐legged partridges displayed the first clinical signs at 3 days post‐inoculation (dpi), and mortality started at 4 dpi, reaching 100% at 8 dpi. The presence of viral antigen in tissues and viral shedding were confirmed by immunohistochemistry (IHC) and quantitative real time RT‐PCR (qRRT‐PCR), respectively, in both HPAIV‐inoculated and ‐contact partridges. Neither clinical signs nor histopathological findings were observed in LPAIV‐infected partridges. In addition, only short‐term viral shedding together with seroconversion was detected in some LPAIV‐inoculated partridges. Study I demonstrates that the red‐legged partridge is highly susceptible to the H7N1 HPAIV strain used, causing severe disease, mortality, and abundant viral shedding, and thus, contributing to the spread of a potential local outbreak of this virus. In contrast, our results concerning H7N9 LPAIV suggest that the red‐legged partridge is not a reservoir species for this virus. In Study II, severe neurological signs and mortality rates of 67% (H7N1/HP) and 92% (H5N1/HP) were observed in HPAIV‐infected European quail. Although histopathological findings were present in both HPAIV‐infected groups, H5N1/HP‐quail displayed a broader viral antigen distribution and extent of microscopic lesions. Neither clinical nor pathological involvement was observed in LPAIV‐infected quail. Consistent long‐term viral shedding and effective transmission to naïve quail was demonstrated for the three studied AIVs. Drinking water arose as a possible transmission route and feathers as a potential origin of HPAIV dissemination. Study II demonstrates that European quail may play a major role in AI epidemiology, highlighting the need to further understand its putative role as an intermediate host for avian/mammalian reassortant viruses. In Study III, falcons exhibited similar infection dynamics regardless the different routes of exposure (i.e., nasochoanal route or by ingestion of infected prey), demonstrating the effectiveness of in vivo feeding route. H5N1/HP‐infected falcons died, or were euthanized, between 5–7 dpi after showing acute severe neurological signs. Presence of viral antigen in several tissues was confirmed by IHC and RRT‐PCR, which was generally associated with significant microscopical lesions, mostly in the brain. Neither clinical signs, nor histopathological findings were observed in any of the H7N2/LP­infected falcons, although all of them had seroconverted by 11 dpi. Avian receptors were strongly present in the upper respiratory tract of the falcons, in accordance with the consistent oral viral shedding detected by RRT‐PCR in both H5N1/HP‐and H7N2/LP‐infected falcons. Study III demonstrates that gyr‐saker hybrid falcons are highly susceptible to H5N1/HP virus infection, as previously observed, and that they may play a major role in the spreading of both HPAIV and LPAIV. For the first time in raptors, natural infection by feeding on infected prey was successfully reproduced. The use of avian prey species in falconry husbandry and wildlife rehabilitation facilities could put valuable birds of prey and humans at risk and, therefore, this practice should be closely monitored. The present dissertation highlights the importance of studying the susceptibility, infection dynamics, and transmission likelihood of AIVs in host avian species at the domestic‐wild interface. Such knowledge is crucial to effectively perform surveillance efforts, develop appropriate preventive measures, and successfully manage AI outbreaks when different avian species are involved. La influença aviària (IA) s’ha convertit en un dels reptes més importants que mai hagi sorgit del reservori animal. Els constants brots que s’han detectat arreu del món en aus domèstiques i aus salvatges afecten en gran mesura a l’economia de la indústria avícola, a la conservació de les aus salvatges i a la sanitat animal i pública. El grau de susceptibilitat als virus d’IA (VIA) és extremadament diferent entre les espècies aviàries, igual que succeeix amb la seva possible funció com a sentinelles, hostes intermediaris o reservoris. Fins ara, diversos estudis experimentals i infeccions naturals han avaluat la susceptibilitat de nombroses espècies aviàries menors i majors a diferents VIA d’alta patogenicitat (VIAAP) o de baixa patogenicitat (VIABP). Es considera que els gal∙liformes són altament susceptibles, mentre que les aus aquàtiques es consideren reservoris naturals. Tanmateix, existeix molt poca informació sobre la dinàmica d’infecció de la IA en la perdiu roja (Alectoris rufa), en la guatlla europea (Coturnix c. coturnix) i en el falcó híbrid sacre‐grifó (Falco rusticolus x F. cherrug). Aquestes espècies aviàries no convencionals poden suscitar un gran interès a regions geogràfiques determinades, com ara la península Ibèrica. Les espècies esmentades no només pertanyen a la fauna autòctona, sinó que també es crien (normalment en sistemes agrícoles extensius) en benefici dels humans, la qual cosa comporta un estret contacte tant amb humans com amb la fauna local.