Selección de microorganismos con potencial para bioreparar ambientes contaminados por metales pesados. Optimización y aplicación de técnicas de microscopía de alta resolución y de métodos químicos

Abstract

En este trabajo se ha determinado la capacidad bioreparadora de metales de Micrococcus luteus DE2008, un microorganismo heterótrofo aislado directamente de los tapetes microbianos del delta del Ebro, y de Chroococcus sp. PCC 9106, una cianobacteria procedente de la Colección de Cultivos Pasteur. Para ello se han utilizado técnicas microscópicas de alta resolución (óptica y electrónica) y métodos de análisis bioquímicos y químicos con el fin de seleccionar microorganismos con capacidad para bioreparar ambientes naturales contaminados. En este trabajo, los metales ensayados para la selección de microorganismos con potencial bioreparador, han sido: el plomo (Pb (II)), el cobre (Cu (II)) y el cromo trivalente (Cr (III)), ya que los tres se han detectado en el río Ebro. Con el objetivo de determinar el efecto in vivo del cromo sobre los pigmentos fotosintéticos de Chroococcus sp. PCC 9106, se ha utilizado la microscopía láser confocal acoplada a un detector espectrofluorométrico (CLSM-λScan). Los resultados indican que Chroococcus sp. PCC 9106 es tolerante-resistente hasta una dosis de 0.26 mM de Cr (III). Para determinar los cambios en la biomasa total y en la viabilidad de Micrococcus luteus DE2008 y de Chroococcus sp. PCC 9106, en primer lugar se ha optimizado un método que combina el uso de fluorocromos, la microscopía láser confocal y un programa de análisis de imagen (FLU-CLSM-IA); y en segundo lugar se ha aplicado éste método para determinar el efecto de los metales sobre estos dos microorganismos y los resultados demuestran que M. luteus DE2008 presenta a nivel de biomasa total, una mayor resistencia al plomo (1.5 mM) que al cobre (0.1 mM) y que su viabilidad se ve afectada a partir de una concentración de 0.5 mM de Pb (II) y de Cu (II). Por otro lado, la concentración mínima de Cr (III) que tiene un efecto significativo en la biomasa total y en la viabilidad de Chroococcus sp. PCC 9106 es de 1.0 y 0.1 mM, respectivamente. Con el fin de determinar la biocaptación externa e interna del metal, se ha utilizado la microscopía electrónica de barrido (SEM), la microscopía electrónica de transmisión (TEM) y el microanálisis de energía dispersiva por rayos X (EDX) acoplada a estos dos microcoscopios. Los resultados indican que, M. luteus DE2008 es capaz de captar Pb (II) y Cu (II) extracelularmente, mientras que Chroococcus sp. PCC 9106 capta el Cr (III) extra e intracelularmente. Finalmente para determinar la eficiencia de captación de los microorganismos ensayados a los diferentes metales pesados se ha utilizado un espectrómetro de emisión óptica de plasma acoplado inductivamente (ICP-OES). El cálculo de la eficiencia de biocaptación se basa en el porcentaje de bioabsorción (%) y en la capacidad específica de biocaptación de metales (q). Los resultados demuestran que M. luteus DE2008 tiene una mayor afinidad por el Pb (II) que por el Cu (II), ya que el porcentaje de bioabsorción (%) y la q son mayores en ambos casos para el plomo. Por otra parte, en el caso de Chroococcus sp. PCC 9106, el tiempo requerido para que la biocaptación del Cr (III) llegue al equilibrio es de 72h, siendo la q en este período de tiempo de 54 mg/g con un porcentaje de bioabsorción del 62%. Considerando todos los resultados obtenidos, se puede concluir que M. luteus DE2008 y Chroococcus sp. PCC 9106 podrían ser considerados como buenos bioreparadores de ambientes contaminados por metales. Ello es debido a que cumplen las siguientes características: son microorganismos autóctonos; fáciles de cultivar en condiciones de laboratorio; capaces de captar los metales extra y/o intracelularmente y presentan una alta tolerancia y una alta afinidad en la biocaptación de los metales.

This study determines the metal bioreparation capacity of Micrococcus luteus DE2008, an heterotrophic microorganism isolated directly from the microbial mats of the Ebro delta, as well of that of Chroococcus sp. PCC 9106, a cyanobacterium from the Pasteur Culture Collection. To do this, high resolution microscopic techniques (optical and electron), as well as biochemical and chemical methods have been used in order to select microorganisms with the ability to biorepair contaminated natural environments. In this work, the metals determined for the selection of microorganisms with biorepair potential were: lead (Pb (II)), copper (Cu (II)), and trivalent chromium (Cr (III)), since the three of them have been detected in the Ebro river. . A confocal laser scanning microscope connected to a spectrofluorimetric detector (CLSM- λScan) was used to determine the in vivo effect of chromium on the photosynthetic pigments of Chroococcus sp. PCC 9106. The results showed that Chroococcus sp. PCC 9106 is tolerant-resistant up to metal dose of 0.26 mM of Cr (III). In order to determine the changes in the total biomass and in the viability of Micrococcus luteus DE2008 and Chroococcus sp. PCC 9106, firstly, a method was optimised that combined the use of fluorochromes, the confocal scanning microscope, and an image analysis program (FLU-CLSM-IA). This method was then applied to determine the effect of the metals on these two microorganisms. The results demonstrated that the total biomass of M. luteus DE2008 had a higher resistance to lead (1.5 mM) than to copper (0.1 mM), and the viability of this microorganism was seen to be affected from a concentration of 0.5 mM for Pb (II) as well as for Cu (II). On the other hand, the minimum concentration of Cr (III) that had a significant effect on the total biomass and on the viability of Chroococcus sp. PCC 9106 was 1.0 and 0.1 mM, respectively. In order to determine the external and internal sequestration of the metal, a scanning electron microscope (SEM), a transmission electron microscope (TEM), and an energy-dispersive X-ray (EDX) spectrometer coupled to these two microscopes were used. The results showed that M. luteus DE2008 is only able to capture Pb (II) and Cu (II) extracelullarly, whilst Chroococcus sp. PCC 9106 captured Cr (III) extra and intracellularly. Finally, inductively coupled plasma optical emission spectrometry (ICP-OES) was used to determine the uptake efficiency of the two microorganisms with the different heavy metals. The calculation of the uptake efficiency was based on the percentage of bioabsorption (%) and on the specific metal biouptake capacity (q). The results showed that M. luteus DE2008 had a higher affinity for Pb (II) than for Cu (II), since the percentage of bioabsorption (%) and the specific uptake capacity (q) were higher for lead in both cases. On the other hand, in the case of Chroococcus sp. PCC 9106, according to the kinetic study, the time required for the uptake of Cr (III) to reach equilibrium (time in which the uptake capacity is maximum) was 72 hours, the (q) being in this period of time 54 mg/g with a percentage of bioabsorption 62%. Taking into account all the results obtained, it can be concluded that M. luteus DE2008 and Chroococcus sp. PCC 9106 could be considered to bioremediate environments contaminated by metals. This due to the fulfilling of the following characteristiques: they are native microorganisms; easy to culture under laboratory conditions, capable of uptaking metals extra and/or intracellularly, and finally, have a high tolerance and a high affinity in the uptake of metals.