Epigenetic deregulation of WT1 and AWT1 in hematological maligancies

Abstract

En l’última dècada, s’ha posat en evidència que el càncer és tant una malaltia genètica com epigenètica. La desregulació epigenètica pot afectar molts processos cel·lulars, com són el silenciament de gens supressors de tumors, l’activació d’oncògens, l’inestabilitat genòmica i/o la desregulació d’expressió de gens impremtats. Aquesta última, és l’expressió monoal·lèlica parental dictada a través de regions de metilació diferencial, heretades de la línia germinal. Aquests gens, en càncer es troben pertorbats, contribuint a la iniciació i progressió del càncer. En neoplàsies hematològiques es desconeix la desregulació d’aquests transcrits. El gen WT1, segons els seu context cel·lular, pot actuar com un suppressor de tumors o com un oncogen, a més a més, presenta unes isoformes d’expressió paterna, el transcrit alternatiu AWT1 i l’antisense WT1-AS. Aquesta expressió al·lèlica es creu que és regulada per una regió diferencialment metilada (DMR), coneguda com la regió reguladora de WT1 antisense. Curiosament, l'expressió de WT1 està desregulada en neoplàsies hematològiques, i s'utilitza rutinàriament com un marcador residual de la malaltia en leucèmies mieloides agudes. S’ha caracteritzat l’epigenètica de les regions promotores de WT1 i AWT1, per identificar el mecanisme que condueix a l'expressió aberrant, i si la pèrdua d'empremta n’és la causa. Utilitzant diverses tècniques moleculars no es va ser capaç d'identificar la metilació al·lèlica dins de l'interval del promotor de WT1, però tot i això s’observa un augment temporal en la metilació, coherent amb resultats publicats prèviament. Malgrat no trobar aquesta regió impremtada, s’observa que aquesta regió s’hipermetila amb freqüència en leucèmies i limfomes, i que la hipermetilació del promotor AWT1 es produeix en el 100% de línies cel·lulars d’AML, malgrat els alts nivells d’expressió. A més a més, la hipermetilació s'associa amb un canvi concomitant en les modificacions d'histones, d’un estat permissiu a un estat d’heterocromatina. En l’anàlisi de metilació de DNA en mes de 169 mostres de leucèmia primària, es va observar una hipermetilació en un 89% de les mostres de AML, independentment de mutacions i/o translocacions/fusions, a més a més de ser un marcador molecular prometedor per a la AML, amb un valor predictiu positiu de 100% i valor predictiu negatiu de 87,6%. Malgrat aquest perfil epigenètic extens, tant a nivell de promotor com a nivell de miRNA, l'única correlació que s’observa amb l’expressió de WT1/AWT1 en AML és la co-expressió del factor de transcripció, GATA-2, que s'uneix a un enhancer situat al 3'UTR de WT1. Aquesta observació, porta a la hipòtesi que GATA-2 indueix l’expressió de WT1/AWT1, i aquest inicia un mecanisme autoregulador en què interactua WT1 i recluta les metiltransferases d'DNA als llocs d’unió de WT1/EGR-1 al promotor d’AWT1 hipermetilant-lo.

Intense research over the past decade has revealed that cancer is much an epigenetic as a genetic disease. The epigenetic deregulation can disrupt many cellular processes resulting in silencing of tumor suppressor genes, activation of oncogenes, genome instability and inappropriate imprinted gene expression. The latter process is the parental of origin monoallelic expression that is dictated by regions of differential methylation inherited from the germline, that when disrupted contributes to the initiation and progression of cancer. In hematological malignancies very little is known about the deregulation of imprinted transcripts. The WT1 gene has various transcripts that act as a tumor suppressor and an oncogene depending on the cellular context, and for which paternal expression of the alternative AWT1 and antisense isoforms has been reported. This allelic expression is postulated to be regulated by a tissue-specific differential methylation region (DMR), known as the WT1-antisense regulatory region. Interestingly, WT1 expression is aberrantly up regulated in hematological malignancies and is routinely used as a molecular marker for minimal residue of disease in acute myeloid leukemia. Herein, we have fully characterized the epigenetic landscape encompassing the WT1 and AWT1 promoter regions in an attempt to identify the mechanism leading to aberrant expression, and whether loss-of-imprinting is routinely observed. Using various molecular techniques we fail to identify allelic methylation within the WT1 promoter interval, but we observe a temporal increase in methylation that is consistent with previous reports. Despite conclusive evidences for lack of imprinting, we found that the region frequently becomes hypermethylated in leukemias and lymphomas, and that hypermethylation of the AWT1 promoter occurs in 100 % of AML cell lines despite the high expression levels. Further characterization of myeloid derived leukemia cell lines revealed that this cancer-associated hypermethylation is associated with a concomitant switch in histone modifications, from a permissive to a heterochromatic state. DNA methylation analysis in more than 169 primary leukemia samples revealed that this hypermethylated signature occurs in 89% of AML samples, independent of underlying mutations or translocation/fusion proteins, and is a promising molecular marker for AML, having a positive predictive value of 100% and a negative predictive value of 87.6%. Despite this extensive epigenetic profiling, both at the promoter and at the miRNA level, the only correlation we observe with WT1/AWT1 expression in AML is the co-expression of the transcription factor, GATA-2, which binds to the enhancer located in the 3’UTR of WT1. This observation, lead us to hypothesize that GATA-2 induced expression of WT1 initiating an auto-regulative mechanism in which WT1 interacts and recruits the DNA methyltransferases to degenerative WT1/EGR-1 binding sites within the AWT1 promoter, leading to its hypermethylation.