Molecular pathways regulated by the ETV5 transcription factor in the invasion of endometrial cancer

Abstract

El càncer d’endometri és la malaltia més freqüent del tracte genital femení en països desenvolupats. L’aparició de símptomes en estadis primerencs [1], contribueix a la detecció de la malaltia en estadis no avançats i amb un alt índex de supervivència. No obstant, en el 20 % dels casos, el diagnòstic es més tardà i els pacients pateixen infiltració miometrial i/o afectació limfàtica. La invasió miometrial, que indica invasió tumoral, és el factor pronòstic més important i determina l’augment de l’índex de recurrència després del tractament quirúrgic i la disminució de l’índex de supervivència als 5 anys. Conseqüentment, el descobriment dels passos inicials associats amb la infiltració miometrial és fonamental per identificar nous agents terapèutics per la prevenció de la disseminació del càncer. Per assolir aquest propòsit, el principal objectiu del nostre grup durant els últims anys ha estat la identificació de mecanismes moleculars involucrats en la invasió i la disseminació del càncer d’endometri. Hem identificat el factor de transcripció ETV5 com el principal agent de la invasió miometrial en les cèl·lules tumorals endometrials. ETV5 està específicament sobreexpressat en el tumor d’endometri invasiu [2] i és capaç d’activar la metaloproteassa MMP2 promovent la migració i la invasió cel·lular in vitro i in vivo [3]. A més, hem demostrat el paper d’ETV5 en la inducció de l’EMT (transició epiteli-mesènquima) que provoca l’adquisició de capacitats invasives i migratòries del tumor. El principal objectiu d’aquesta tesi és la identificació de noves molècules involucrades en la invasió miometrial. En particular, ens hem focalitzat en la identificació de noves dianes d’ETV5 que participen en l’adquisició de propietats migratòries i invasives de les cèl·lules tumorals en el carcinoma endometrial. Per caracteritzar els passos inicials de la invasió miometrial regulada per ETV5, vam analitzar mitjançant l’estudi diferencial d’expressió gènica aquells gens que estaven alterats en cèl·lules de càncer d’endometri Hec1a amb una sobrexpressió estable de la proteïna de fusió GFP-ETV5, comparat amb les cèl·lules Hec1a control. En particular, vam identificar NID1 i NUPR1 com a directes dianes transcripcionals d’ETV5. NID1 és una proteïna que forma part de la matriu extracel·lular juntament amb la laminina [4]. NUPR1 és una proteïna del grup de les HMG i la seva principal funció és unir-se a la cromatina dels promotors per modificar l’accessibilitat de la cromatina durant la regulació gènica [5]. Vam voler examinar el paper de NID1 i NUPR1 coma mediador de les funcions d’ETV5 en les cèl·lules Hec1a de càncer d’endometri in vitro i in vivo utilitzat un model animal [6]. Junts, els nostres resultats suggereixen que la regulació de NID1 mitjançant ETV5 genera la invasió cel·lular i l’adhesió a la matriu extracel·lular, i la regulació de NUPR1 mitjançant ETV5 provoca la migració cel·lular en la línia cel·lular de càncer d’endometri in vitro. D’altra banda, proposem que NID1 i NUPR1 regulen la migració i la invasió, cel·lular en part, mitjançant la regulació indirecte de la N-cadherina. També vam poder observar que els ratolins injectats amb cèl·lules que presentaven NID1 silenciat generaven tumors de mida inferior que els injectats amb cèl·lules control. D’altra banda, els ratolins injectats amb cèl·lules amb NUPR1 o NID1 silenciats generaven menys metàstasis que els injectats en cèl·lules control suggerint que NID1 i NUPR1 mitjançant ETV5 estan involucrats en la progressió i la disseminació tumoral in vivo. Finalment, per tal de confirmar la regulació de NID1 i de NUPR1 per ETV5, vam examinar el paper d’ambdós gens en mostres humanes de càncer d’endometri i la seva associació amb les característiques clíniques i patològiques. En estudis previs, vam descriure la sobreexpressió d’ETV5 en el carcinoma d’endometri, concretament el front d’invasió del tumor [7]. En aquest estudi, hem trobat que l’expressió de NID1 i d’ETV5 està clínicament correlacionada en mostres humanes de càncer d’endometri tan a nivell de mRNA com de proteïna. A més a més, em pogut observar una sobreexpressió de NID1 i de NUPR1 en el front d’invasió del tumor tant a nivell de mRNA con de proteïna. Com conclusió, aquestes dades presentades en aquesta tesi contribueixen al descobriment de mecanismes moleculars involucrats en la disseminació del càncer d’endometri. El descobriment de les bases moleculars de la invasió en el carcinoma endometrial contribuirà en el desenvolupament d’estratègies terapèutiques més específiques i efectives.

Endometrial cancer is the most frequent malignancy of the female genital tract in Western countries. The early appearance of symptoms [1], contributes to the earlier detection of this malignancy and results in better survival rates. However, in 20% of cases the diagnosis is delayed and patients present with myometrial infiltration and/or lymph node affectation. Myometrial invasion, an initial event that signals tumour invasion is one of the most valuable prognostic factors and it determines increased recurrence rates after the first surgical treatment and decreased 5-year survival. Consequently, unravelling the initial steps associated with myometrial infiltration is fundamental to identify new therapeutic agents for the prevention of cancer dissemination. To this end, the major scientific aim of our group during the past few years has been the identification of the molecular mechanisms involved in endometrial cancer invasion and dissemination. We identified ETV5 transcription factor as an important agent of myometrial invasion by endometrial tumour cells. ETV5 is specifically upregulated in invasive endometrial tumours and is able to [2] activate the metalloproteinase MMP2, thus promoting cell migration and invasion in vitro and in vivo [3]. In addition, we demonstrated the role of ETV5 on the induction of EMT, which result in the acquisition of migratory and invasive capabilities. The main objective of this thesis is to identify new molecules involved in the myometrial invasion of endometrial cancer. In particular, we have focused on the identification of new ETV5 downstream targets that mediate the role of ETV5 in the endometrial tumour cells’ acquisition of migratory and invasive properties. To further characterise the initial steps of myometrial invasion regulated by the ETV5 transcription factor, we analysed by gene expression microarray technology those genes whose expression was altered in Hec1A endometrial cancer cells with stable overexpression of a fusion GFP-ETV5 protein, compared with Hec1A control cells. In particular, we have identified NID1 and NUPR1 as direct transcriptional targets of ETV5. NID1 is a ubiquitous protein component of the BM and a partner of laminin [4]. NUPR1 is a HMG protein and its principal role in the cell is to bind to the chromatin promoters to modify the accessibility of chromatin in gene regulation [5]. We wanted to examine the role of NID1 and NUPR1 as a mediator of ETV5 functions in Hec1A endometrial cancer cells in vitro and in vivo using an orthotopic mouse model [6]. Our results suggest that NID1 regulation by ETV5 enhances cell invasion and cell adhesion to the extracellular matrix, and that NUPR1 regulation by ETV5 enhances cell migration in endometrial cancer cells in vitro. We propose that NID1 and NUPR1 regulation of cell migration and invasion may be in part mediated by the regulation of N-cadherin. We also observed that the mice injected with cells with NID1 silenced, generated a small size tumours compared with mice injected with control cells. Moreover, we found that mice injected with cells with NID1 or NUPR1 inhibition produced a decreased number of metastases compared with mice injected with control cells. These results suggest that the regulation of NID1 and NUPR1 by ETV5 contributes to the tumour progression and dissemination in vivo. Finally, in order to confirm the regulation of NID1 or NUPR1 by ETV5, we wanted to examine the role of both NID1 and NUPR1 genes in human endometrial tumour samples and their association with clinical and pathological characteristics In previous studies, ETV5 was upregulated in human endometrial tumour samples compared with control tissue, in particular in the invasion front of endometrial tumours [7]. We found that the expression of NID1 and ETV5 were clinically correlated in human endometrial tumour samples at mRNA level and at the protein level. Moreover, we observed a upregulation of NID1 and NUPR1 in invasion front of the tumour. In conclusion, the data presented in this thesis contributes to the elucidation of the molecular mechanisms involved in endometrial cancer dissemination. Understanding the molecular basis of myometrial invasion in endometrial cancer will contribute to the development of more specific and more effective therapeutic strategies.