Bases bioquímiques i genètiques de les deplecions De mtDNA i de les alteracions de NFU1

Abstract

Les deplecions de DNA mitocondrial (mtDNA) i les alteracions de NFU1 són dos grups de malalties que afecten vies molt importants dins de la mitocòndria i que alteren el metabolisme energètic. Clínicament, els pacients afectes de depleció de mtDNA es caracteritzen per mostrar un ampli ventall de símptomes, depenent del gen afectat. Els símptomes clínics són molt greus i la majoria de vegades porten a la mort del pacient. Els pacients amb mutacions en el gen NFU1, descrits per primera vegada en aquest treball, presenten una clínica més homogènia, caracteritzada sobretot per presentar una encefalopatia infantil fatal i/o hipertensió pulmonar i un fenotip bioquímic molt particular però ben definit, caracteritzat principalment per presentar acidosi làctica, hiperglicinèmia i deficiència de l’activitat piruvat deshidrogenasa. L’objectiu principal d’aquesta tesis ha consistit en millorar i implementar metodologies per a contribuir al diagnòstic, i millorar la comprensió de la fisiopatologia d’aquestes deficiències. Per a tal fita s’ha posat a punt una tècnica de PCR a temps real per estudiar el número de còpies de mtDNA i poder relacionar-lo amb l’activitat citrat sintasa. A més, la depleció s’ha pogut estudiar en biòpsies incloses en parafina, una important font de material biològic arxivat mai utilitzat fins al moment. D’aquesta forma s’han pogut estudiat 50 pacients amb sospita clínica de depleció de mtDNA i cercar mutacions en els gens relacionats; DGUOK, MPV17, C10orf2, SUCLG1, SUCLA2 i POLG. L’estudi molecular ens ha permès identificar 4 mutacions no descrites prèviament, c.70+5G>A en el gen MPV17, c.1048G>A i c.1049G>T en el gen SUCLA2, i c.531+4A>T en el gen SUCLG1. A més s’han identificat 7 mutacions prèviament descrites en un total de 10 pacients (8 famílies). Quan va ser possible, es va quantificar el ràtio mtDNA/nDNA i la activitat citrat sintasa en la mateixa mostra de teixit, proveint noves dades per l’estudi de les MDS. La depleció relacionada amb la citrat sintasa, (mtDNA/nDNA)/CS, ha donat resposta a certes discrepàncies observades entre els resultats de depleció i els resultats de la cadena respiratòria mitocondrial en alguns pacients. Per altra banda, utilitzant el mapatge per homozigositat, es va identificar una mutació de canvi de sentit en homozigositat en el gen NFU1 (c.622G>T, p.Gly208Cys), que codifica per una proteïna altament conservada en totes les espècies i que està implicada en la biogènesis dels clústers de sulfur de ferro (Fe-S). Aquesta ha esta la primera vegada que s’ha associat mutacions en aquest gen a patologia humana. El fenotip bioquímic dels pacients suggeria una activitat deficient de l’enzima lipoic àcid sintasa (LAS), una proteïna que necessita clústers de Fe-S com a cofactor. Es va poder constatar una disminució del grau de lipoilació de les proteïnes dependents d’àcid lipoic, el que suggeria una manca d’ activitat LAS. Utilitzant models cel·lulars hem demostrat que la proteïna NFU1 és necessària com a donadora de sulfur per la biosíntesi d’àcid lipoic i també ens ha permès conèixer la funció específica en la biosíntesi dels clústers de Fe-S i en la maduració de proteïnes Fe-S, concretament LAS i la succinat deshidrogenasa (SDH). La descripció clínica, bioquímica y genètica d’aquesta malaltia és molt important pel diagnòstic de nous pacients i obre les portes a la cerca d’altres gens implicats en la biosíntesi de l’àcid lipoic, així com al disseny futur de noves estratègies terapèutiques.

Mitochondrial DNA (mtDNA) depletion syndromes (MDS) and NFU1 defects are two groups of diseases affecting crucial mitochondrial pathways of energetic metabolism. Clinically, patients affected of mtDNA depletion displayed a wide range of symptoms, depending on the altered gene. The clinical symptoms are severe and in most cases lead to death of the patient. Patients with NFU1 mutations, described for the first time in this paper, present a more homogeneous clinical phenotype, characterized by fatal infantile encephalopathy and / or pulmonary hypertension. NFU1 patients also showed a peculiar, but well defined, biochemical phenotype, presenting with lactic acidosis, hyperglycinemia and deficiency of pyruvate dehydrogenase activity. The main objective of the present thesis is to improve and to implement new methods for the diagnosis and understanding of the pathophysiology of these deficiencies. To this goal, a real-time PCR technique has been developed to study the mtDNA copy number and its relationship to citrate synthase activity in MDS patients. In addition, mtDNA depletion has been studied in formalin-fixed paraffin-embedded tissues, an important source of biological material never used for this purpose. We studied 50 paediatric individuals suspected to have mtDNA depletion and the appropriate MDS genes have been screened according to their clinical and biochemical phenotypes. Mutational study of DGUOK, MPV17, SUCLA2, SUCLG1 and POLG allowed us to identify 4 novel mutations; c.70+5G>A in MPV17, c.1048G>A and c.1049G>T in SUCLA2 and c.531+4A>T in SUCLG1, and 7 already known mutations in 10 patients (8 families). When possible, we quantified mtDNA/nDNA and CS activity in the same tissue sample, providing an additional tool for the study of MDS. The ratio (mtDNA/nDNA)/CS has shed some light in the discrepant results between the mtDNA copy number and the enzymatic respiratory chain activities of some cases. Using homozigosity mapping, we identified a homozygous missense mutation in NFU1 gene (c.622G> T, p.Gly208Cys), which encodes a conserved protein suggested to participate in Fe-S cluster biogenesis. This is the first time that a clinical phenotype has been associated with mutations to NFU1. The biochemical phenotype suggested an impaired activity of the Fe-S enzyme lipoic acid synthase (LAS), a protein that requires Fe-S cluster as a cofactor. Direct measurement of protein-bound lipoic acid in individual tissues indeed showed marked decreases, which suggested a lack of LAS activity. Human cell models studies showed that NFU1 protein is required as sulfur donor for the biosynthesis of lipoic acid and it performs a specific function in mitochondrial Fe-S proteins maturation, particularly succinate dehydrogenase and LAS (SDH). Clinical, biochemical and genetic description of NFU1 disease is very important for the diagnosis of new patients and will allow us to find other genes involved in the biosynthesis of lipoic acid, and provided the basis for the future design of new therapeutic strategies.