Insights on the interaction between Haemophilus parasuis and alveolar macrophages

Abstract

Haemophilus parasuis és un bacteri de la família Pasteurellaceae. És un colonitzador del tracte respiratori superior en animals sans i l’agent etiològic de la malaltia de Glässer. Les soques de H. parasuis presenten diferències en virulència, que han estat observades tant en infeccions in vivo com en proves de fagocitosi in vitro amb macròfags alveolars porcins (PAMs). La patogenicitat de les soques ha estat correlacionada amb la resistència a la fagocitosi, però els factors de virulència implicats son desconeguts. Per la identificació dels factors implicats en la resistència a la fagocitosi, es va generar una llibreria genòmica de la soca virulenta de referència Nagasaki. De la incubació d’aquesta llibreria amb PAMs, es varen seleccionar dos clons amb gens codificant dos autotransportadors trimètrics associats a virulència (VtaA), vtaA8 i vtaA9. Mitjançant citometria de flux, es va aprofundir en el paper d’aquestes molècules en ambdós clons, els quals van mostrar una menor interacció amb els PAMs. La producció d’anticossos monoclonals (mAb) contra les proteïnes recombinants VtaA8 i VtaA9 van permetre determinar‐ne la localització a la superfície dels clons. Els mateixos mAb detectaren aquestes proteïnes a la superfície de la soca resistent a la fagocitosi PC4‐6P, però no a la soca avirulenta F9. Addicionalment, estudis amb microscòpia de fluorescència varen determinar l’efecte de VtaA8 i VtaA9 en el transport a la ruta endocítica, tot detectant un retard en la co‐localització dels clons vtaA8 i vtaA9 amb compartiments àcids. Aquests resultats són compatibles amb una inhibició parcial del transport del bacteri a través de la degradació per fagosoma. Finalment, els anticossos contra un epítop comú a VtaA8 i VtaA9 van ser opsonitzadors i varen promoure la internalització de la soca resistent a la fagocitosi PC4‐6 pels PAMs. Globalment, aquests resultats indiquen que VtaA8 i VtaA9 són proteïnes de superfície i juguen un paper en la resistència a la fagocitosi. La infecció de garrins privats de calostre nascuts de part natural amb soques de H. parasuis va mostrar diferències en el grau de virulència. Es varen emprar quatre soques de H. parasuis: les soques de referència virulenta Nagasaki i avirulenta SW114, la soca de camp IT29205 (obtinguda d’una lesió i virulenta en una infecció anterior) i la soca F9 (aïllada de la cavitat nasal d’un garrí sa). Els animals es varen inocular per via intranasal amb 107‐108 CFU per individu. Dos animals no infectats s’utilitzaren com a controls. A diferents temps (1, 2, 4 i 7 dies post‐infecció [dpi]), dos animals de cada grup es varen eutanasiar, i es varen prendre mostres de sèrum i del fluid bronquialveolar. Mitjançant citometria de flux, es varen analitzar els macròfags alveolars avaluant l’expressió dels marcadors de superfície CD163, CD172a, SLAI, SLAII, sialoadhesina, CD14 i SWC8. En funció de la virulència de la soca es varen poder observar canvis en el fenotip dels macròfags. A la fase inicial de la infecció (1 dpi), les soques no virulentes SW114 i F9 varen induir major expressió de CD163, sialoadhesina, SLAII i CD172a que les soques virulentes Nagasaki i IT29205. A 2 dpi, la situació canvià diametralment. Les soques virulentes generaren una forta inducció de l’expressió de CD172a, CD163 i sialoadhesina, seguida a continuació d’un sobtat increment d’IL‐8 i CD163 soluble a 3‐4 dpi. L’activació primerenca dels macròfags per part de les soques virulentes podria ser crítica per originar malaltia. L’associació entre el retard produït per les proteïnes VtaA8 i VtaA9 i la ruta endocítica, així com el retard en l’activació del macròfag, requereix estudis ulteriors.

Haemophilus parasuis, a member of the family Pasteurellaceae, is a colonizer of the upper respiratory tract of healthy pigs and the etiological agent of Glässer’s disease. Differences in virulence among H. parasuis strains have been widely observed by different tests, including in vivo infections and in vitro phagocytosis assays with porcine alveolar macrophages (PAMs). The pathogenicity of the strains has been correlated with resistance to phagocytosis, but the bacterial factors implicated are not known. To identify virulence factors involved in phagocytosis resistance, a genomic library of the virulent reference strain Nagasaki was produced and exposed to PAMs. After incubation with PAMs, two clones carrying two different virulent‐associated trimeric autotransporters (VtaA), vtaA8 and vtaA9, were selected. The role of these molecules was further investigated and a reduction in the interaction of the two clones with the macrophages was detected by flow cytometry. Monoclonal antibodies (mAb) produced against the recombinant VtaA8 and VtaA9 proteins demonstrated the presence of these proteins on the bacterial surface of the corresponding clone. The same mAb also detected the proteins on the surface of H. parasuis phagocytosis‐resistant strain PC4‐6P, but not on the non‐virulent strain F9. The effect of VtaA8 and VtaA9 in the trafficking of the bacteria through the endocytic pathway was examined by fluorescence microscopy and a delay was detected in the localization of the vtaA8 and vtaA9 clones in acidic compartments. Although VtaA8 and VtaA9 delayed phagocytosis, were not sufficient to completely inhibit the process. These results are compatible with a partial inhibition of the routing of the bacteria via the degradative phagosome. Finally, antibodies against a common epitope in VtaA8 and VtaA9 were opsonic and promoted phagocytosis of the phagocytosis‐resistant strain PC4‐6P by PAMs. Taken together, these results indicate that VtaA8 and VtaA9 are surface proteins that play a role in phagocytosis resistance of H. parasuis. Infection of snatch farrowed, colostrum‐deprived piglets with different strains of H. parasuis demonstrated differences in the degree of virulence. We used four strains of H. parasuis: reference virulent strain Nagasaki, reference non‐virulent strain SW114, and field strains IT29205 (from systemic lesion and virulent in a previous challenge) and F9 (from nasal cavity of a healthy piglet). The infection was performed intranasally with 107‐108 CFU per animal. Two non‐infected animals served as controls. At different times after infection (1, 2, 4 and 7 days post‐infection [dpi]), two animals of each group were euthanized and bronchoalveolar lavages and sera were collected. Alveolar macrophages were analyzed for the expression of surface markers CD163, CD172a, SLAI, SLAII, sialoadhesin, CD14 and SWC8 by flow cytometry. The phenotype of macrophages changed along with the infection depending on the virulence of the strain. At early time‐points (1 dpi), non‐virulent strains SW114 and F9 induced higher expression of CD163, sialoadhesin, SLAII and CD172a than virulent strains Nagasaki and IT29205. At 2 dpi, the situation switched to a strong induction of expression of CD172a, CD163 and sialoadhesin by the virulent strains, which was followed by a steep increase in IL‐8 and soluble CD163 at 3‐4 dpi. The early delay in macrophage activation by virulent strains may be critical for disease establishment. The association between the delay produced by VtaA8 and VtaA9 in the endocytic route and the delay in macrophage activation needs further study.