Biocatalyst and bioprocess engineering for the synthesis of aminopolyols by enzymatic oxidation and aldol addition

Abstract

La utilización de enzimas como catalizadores de procesos tiene interés debido a aspectos medioambientales y a sus principales propiedades: alta selectividad y especificidad y alta capacidad catalítica bajo condiciones suaves de operación. En esta tesis doctoral se desarrolló la síntesis enzimática de un Cbz-aminopoliol, compuesto de interés terapéutico, mediante un sistema multienzimático basado en el acoplamiento de la oxidación de un aminoalcohol a su correspondiente aminoaldehído y su posterior adición aldólica a dihidroxiacetona fosfato (DHAP). Se seleccionó Cbz-etanolamina como aminoalcohol modelo. Primero se estudió la oxidación de Cbz-etanolamina a Cbz-glicinal empleando la enzima cloroperoxidasa (CPO) de Caldariomyces fumago como biocatalizador. El oxidante más adecuado para la reacción fue hidroperóxido de tert-butilo (t-BuOOH). Para minimizar la desactivación enzimática causada por la presencia de peróxido, se estudiaron diferentes estrategias de adición del mismo. El mayor rendimiento de Cbz-glicinal, de 39,1%, se alcanzó con una velocidad de adición de 3 mM/h. Además, se analizaron diferentes medios de reacción para aumentar la concentración de substrato favoreciendo la velocidad de reacción y la producción de Cbz-glicinal. Aplicando dioxano a una concentración del 5% la producción de Cbz-glicinal fue 6 veces mayor que la máxima obtenida en medio acuoso (47,6 y 7,8 mM respectivamente). Posteriormente, para aumentar la estabilidad de CPO se aplicaron técnicas de modificación química: modificaciones selectivas de grupos amino en residuos de Lys y grupos carboxilo en residuos de Asp y Glu así como entrecruzamiento y oxidación de azúcares con periodato. Se evaluó la estabilidad de las enzimas modificadas a diferentes valores de pH, temperatura y en presencia de t-BuOOH. Además se estudió el efecto de las modificaciones de CPO en la oxidación de Cbz-etanolamina. Las modificaciones de grupos carboxilo mediante adición de carbodiimida y las modificaciones resultantes de la oxidación de azúcares con periodato resultaron ser mejores catalizadores que la enzima CPO nativa en términos de estabilidad y actividad a valores elevados de pH y temperatura. A 50ºC y velocidad de adición de peróxido de 12 mM/h, los rendimientos de Cbz-glicinal aumentaron desde 16,1% (utilizando enzima nativa) a 21,5-22,1% (utilizando catalizadores modificados). Sin embargo, estos resultados no resolvieron el problema de la rápida desactivación irreversible de CPO. Buscando un mayor aumento de la estabilidad de CPO se aplicaron diferentes métodos de inmovilización: adsorción iónica, enlace covalente mediante adición de carbodiimida y enlace covalente de la enzima oxidada en geles de monoaminoetil-N-aminoetil (MANA) agarosa, así como enlace covalente en soportes Eupergit® C. Se optimizaron las condiciones de trabajo para cada método de inmovilización con el objetivo de maximizar los rendimientos de inmovilización y minimizar la desactivación enzimática durante el proceso de inmovilización. Además, se analizó la presencia de limitaciones difusionales en la catálisis con enzimas inmovilizadas, así como la estabilidad de dichas enzimas en las condiciones necesarias para la reacción de interés. El sistema enzimático más estable resultó ser el obtenido mediante enlace covalente en MANA-agarosa por adición de carbodiimida. Este catalizador se aplicó en la síntesis de Cbz-glicinal, obteniéndose una conversión más alta que la obtenida en la reacción catalizada por la enzima soluble (59,9 y 47,9%, respectivamente). Finalmente, se llevaron a cabo simultáneamente las reacciones de oxidación de Cbz-etanolamina, catalizada por CPO, y adición aldólica del aminoaldehído resultante a DHAP, catalizada por la enzima recombinante ramnulosa-1-fosfato aldolasa (RhuA) producida en Escherichia coli, obteniéndose un Cbz-aminopoliol ((3R)-5-{[(benziloxi)carbonilo]amino}-5-desoxi-1-O-fosfonopent-2-ulosa) como producto final. Se estudió el efecto de la inmovilización de ambas enzimas, la configuración del reactor y el medio de reacción con el objetivo de aumentar la producción de Cbz-aminopoliol. Aplicando ambas enzimas inmovilizadas en presencia de 5% de dioxano, dicha producción alcanzó un valor de 86,6 mM (31 g/l).

There is a growing interest for the application of the enzymes as process catalysts due to the environmental issues and the unique properties that they provide: high selectivity and specificity, and high catalytic activity while working under mild operational conditions. In this doctoral thesis, the enzymatic synthesis of the valued product Cbz-aminopolyol was achieved in a multienzymatic system by coupling the enzyme catalyzed oxidation of an amino alcohol to the corresponding amino aldehyde and enzyme catalyzed aldol addition to dihydroxyacetone phosphate (DHAP). Cbz-ethanolamine was selected as a model amino alcohol. Firstly, the enzymatic oxidation of Cbz-ethanolamine to Cbz-glycinal was studied by applying chloroperoxidase (CPO) from Caldariomyces fumago as a biocatalyst. The reaction was performed successfully using tert-butyl hydroperoxide as an oxidant. Peroxide addition strategy had to be optimized in order to minimize the peroxide dependent inactivation. Cbz-glycinal yield of 39.1% was reached when the peroxide was added at the rate of 3 mM/h. Furthermore, different reaction media were analyzed looking for the way to increase substrate concentration while favoring reaction rate and Cbz-glycinal production. Use of dioxane in the concentration of 5% resulted in 6-fold improved Cbz-glycinal production compared to the value reached in aqueous reaction (47.6 mM compared 7.8 mM, respectively). Then, with the aim of further improving of the stability of CPO, chemical modifications of CPO were carried out. Side-chain selective modifications of amino groups of Lys residues, and carboxyl groups of Asp and Glu residues, as well as crosslinking and periodate oxidation of sugar moiety were performed. The stability of modified CPOs was evaluated at different pH values, temperatures, and in the presence of tert-butyl hydroperoxide. Effect of modification of CPO on the performance of the reaction of Cbz-ethanolamine oxidation was studied as well. Those modifications that involved carboxyl groups via carbodiimide coupled method and the periodate oxidation of the sugar moiety produced better catalysts than native CPO in terms of stability and activity at elevated pH values and temperatures. At the temperature of 50ºC and peroxide addition rate of 12 mM/h, yields of Cbz-glycinal were improved from 16.1%, the value reached when using native CPO, to 21.5-22.1% when using modified CPOs. Even so, the problem of rapid irreversible inactivation of CPO by peroxides remained unsolved. Expecting a more drastic improvement in CPO stability, different immobilization methods were studied: ionic adsorption, covalent attachment by carbodiimide coupled method, and covalent attachment of oxidized enzyme on monoaminoethyl-N-aminoethyl (MANA) agarose gels as well as covalent attachment on Eupergit® C. Conditions for each immobilization method were optimized in order to maximize the immobilization yields and minimize the enzyme inactivation during the immobilization process. Then, the presence of diffusion limitations of the immobilized enzyme preparations as well as the stability of immobilized enzymes in the conditions at which the reaction of interest takes place were tested. The most stable immobilized enzyme system, covalent attachment on MANA-agarose via carbodiimide coupled method was finally applied as a biocatalyst for the synthesis of Cbz-glycinal reaching higher total conversion (59.9%) than in the reaction catalyzed by soluble enzyme (47.9%). Finally, the reaction of oxidation of Cbz-ethanolamine catalyzed by CPO was successfully coupled in one-pot reactor to the aldol addition of the amino aldehyde with DHAP catalyzed by recombinant rhamnulose-1-phosphate aldolase (RhuA) from Escherichia coli yielding Cbz-aminopolyol ((3R)-5-{[(Benzyloxy)carbonyl]amino}-5-deoxy-1-O-phosphonopent-2-ulose) as a final product. The effect of the immobilization of the enzymes, reactor configuration and reaction medium were studied in order to improve Cbz-aminopolyol production. The production of Cbz-aminopolyol, when catalyzed by immobilized enzymes in presence of 5% dioxane reached the value of 86.6 mM (31 g/l).