Insights into the specificity and function of M14 metallocarboxypeptidases from structural and degradomic studies

Abstract

Las proteasas son enzimas que escinden proteínas catalizando la hidrólisis del enlace peptídico. Todas las proteínas sufren proteólisis en algún momento u otro de su ciclo de vida y de este modo las proteasas regulan casi todos los procesos biológicos. Las carboxipeptidasas son proteasas que hidrolizan el enlace C-terminal de las proteínas y péptidos. En esta tesis se estudia a las carboxipeptidasas de la familia M14 en la clasificación de MEROPS (y que describiremos como metalocarboxipeptidasas). Las metalocarboxipeptidasas controlan importantes procesos biológicos, como son la regulación de la presión sanguínea, el equilibrio entre coagulación y fibrinólisis, o el procesamiento de neuropéptidos y hormonas peptídicas. Además, están implicadas en procesos patológicos como el cáncer o las enfermedades neurodegenerativas. La información disponible sobre la función biológica de estas enzimas es muy limitada, por lo que en la presente tesis se planteó como objetivo profundizar en el estudio de la función de varias metalocarboxipeptidasas. Con esta finalidad se realizaron ensayos cinéticos, estudios de biología celular y de determinación de la estructura tridimensional. Además, se desarrollaron y aplicaron distintas técnicas proteómicas para el estudio de los sustratos de carboxipeptidasas (y que se incluyen por lo tanto dentro del campo de la degradómica). Esta tesis se compone de cuatro trabajos de investigación independientes en los que se caracteriza funcional y estructuralmente a distintas metalocarboxipeptidasas. En el primer trabajo se determinó la estructura tridimensional de una isoforma corta del gen silver de Drosophila melanogaster, correspondiente al primer dominio de la carboxipeptidasa D de mamíferos. La mutación de este gen genera moscas adultas con cutículas pálidas o plateadas y con alas puntiagudas. Esta estructura tridimensional fue obtenida en presencia del inhibidor GEMSA a una resolución de 2,7 Å y se corresponde en general con la estructura canónica de otras carboxipeptidasas de su subfamilia. Presenta sin embargo como elemento distintivo un lazo flexible fácilmente accesible a las proteasas, por lo que la proteólisis podría constituir un mecanismo de regulación de esta enzima. En el segundo trabajo se incluye la caracterización bioquímica y funcional de la carboxipeptidasa A4 humana (CPA4), la cual ha sido asociada con la agresividad del cáncer de próstata. Se determinó que esta enzima es secretada al espacio extracelular y muestra un pH óptimo neutro. Mediante aproximaciones peptidómicas se identificaron distintos péptidos bioactivos como posibles sustratos de la CPA4: la neurotensina, diversas graninas y péptidos opioides tales como la Met- o Leu- encefalina. Estos péptidos están involucrados en la proliferación y diferenciación de las células de cáncer de próstata, y permiten explicar la asociación de esta enzima con la agresividad de este tipo de cáncer. En definitiva, la CPA4 funcionaría en el procesamiento de neuropéptidos a nivel extracelular. El tercer trabajo comprende el desarrollo de una nueva aproximación proteómica para el estudio de las preferencias de sustrato de las carboxipeptidasas. Esta técnica, basada en la tecnología COFRADIC, permite aislar miles de productos de la acción de carboxipeptidasas sobre una librería de péptidos (generada a partir de un proteoma celular). Esta técnica permitió describir las poco caracterizadas preferencias de sustrato de la carboxipeptidasa de mastocitos. En el cuarto trabajo se aplicó una técnica proteómica denominada “COFRADIC C-terminal” que permite la búsqueda de sustratos naturales de carboxipeptidasas. En particular, esta técnica se aplicó a la búsqueda de sustratos naturales de la carboxipeptidasa citosólica 1 (CCP1), la cual estaría asociada a mecanismos de degeneración y regeneración neuronal que aún se desconocen. Se ha propuesto que CCP1 tiene como sustratos a la tubulina y a otras proteínas que presentan residuos de glutámico en su extremo C-terminal. En este trabajo se pudieron identificar 7 nuevos posibles sustratos protéicos para CCP1.

Proteases are enzymes that irreversibly cleave proteins by the catalysis of peptide-bond hydrolysis. With all proteins undergoing proteolysis at any point of their life cycle, proteases regulate virtually every biological process. Carboxypeptidases are proteolytic enzymes that catalyze the hydrolisis of peptidic bonds at the C-terminus of peptides and proteins. In this thesis, we studied carboxypeptidases from the M14 family (according to the MEROPS database classification), hereafter described as metallocarboxypeptidases. Metallocarboxypeptidases play key roles in controlling various biological processes, including blood coagulation/fibrinolysis, blood pressure regulation, pro-hormone and neuropeptide processing; and are also implicated in various pathological conditions such as cancer or neurodegenerative disorders. Despite the important functions performed by these enzymes, there is usually limited knowledge about their in vivo biological roles. The present thesis was aimed to gain insights into the understanding of the biological functions of different metallocarboxypeptidases. For this purpose, we applied different approaches that included kinetic studies, cell biological studies and structural characterization. In addition, we participated in the development of different proteomic tools for protease/carboxypeptidase substrate determination (degradomics). The present thesis consists of four independent research works that focus in the structural and functional characterization of different metallocarboxypeptidases. The first work presents the crystal structure of a short isoform of Drosophila melanogaster silver gene, which corresponds to the first repeat of a mammalian CPD. Silver gene is responsible for the silver mutation, characterized for adult flies that display cuticles that are pale and silvery in color, and pointed wings. This three-dimensional structure was solved in presence of an inhibitor (GEMSA) at 2.7 Å resolution and overall corresponds with the structure of other members of its subfamily of metallocarboxypeptidases. A unique structural element in the here presented structure is a surface hotspot targetable by peptidases, suggesting that this enzyme might be regulated (i.e., inactivated) by proteolysis. The second work comprises the biochemical and functional characterization of human carboxypeptidase A4 (CPA4), an enzyme that has been associated with prostate cancer aggressiveness. We found that this enzyme is secreted outside the cells and displays a neutral pH optimum that is compatible with a function in the extracellular environment. A peptidomic study identified several biologically relevant putative peptidic substrates of CPA4: neurotensin, granins, and opioid peptides such as Met- and Leu-enkephalin. These peptides are involved in the proliferation and differentiation of prostate cancer cells, potentially explaining the link between CPA4 and cancer aggressiveness. Altogether, CPA4 would function in the extracellular neuropeptide processing. The third work comprises the development of a novel proteomic approach to study the substrate preferences of carboxypeptidases. This technology can be described as a COFRADIC-based proteome-derived peptide library approach and allows for the enrichment of thousands of carboxypeptidase products from natural, proteome-derived peptide libraries. This approach served to delineate the previously little studied substrate specificity profile of mouse mast cell carboxypeptidase. In the fourth work we applied a proteomic tool (C-terminal COFRADIC) that allows searching for natural substrates of carboxypeptidases. Particularly, we searched for natural substrates of cytosolic carboxypeptidase 1 (CCP1) in a cellular system. This enzyme is considered to be a molecular link between neuronal degeneration and regeneration, although the molecular pathways in which CCP1 is implicated remain undefined. It has been proposed that CCP1 would posttranslationally modify tubulin and other proteins that present glutamate-stretches in their C-terminus. Here, we were able to identify seven new putative CCP1 protein substrates.