Design and applications for quantum-onion-multicode nanospheres and other luminescent semiconductor-derived nanocomposites

Abstract

Los puntos cuánticos son nanopartículas semiconductoras que exhiben unas propiedades ópticas y electrónicas dependientes del tamaño. Debido a sus dimensiones en el rango de 1-100 nm, la relación superficie-volumen de estos materiales llega a ser enorme y sus estados electrónicos se vuelven discretos. Además, por el hecho de que el tamaño del nanocristal es más pequeño que el de un excitón, las cargas están espacialmente confinadas y esto eleva sus energías en lo que se conoce como confinamiento cuántico. Así, las propiedades optoelectrónicas están atribuidas a este efecto de confinamiento y esto permite calibrar la emisión. Los puntos cuánticos tienen una fluorescencia muy estable en comparación con los fluoróforos orgánicos que la pierden en cuestión de minutos. Además, y contrariamente a los fluoróforosogánicos, estos nanocristales tienen una amplia excitación y una emisión estrecha lo que los hace extremadamente aplicables para visualización multicolor. Calibrar la longitud de onda de emisión de los puntos cuánticos es simplemente una cuestión de calibrar su tamaño. Por todo estas razones, explicadas en el capítulo 1, los puntos cuánticos han desplazado a los fluoróforos convencionales como método para visualización en los últimos 5 años. Estos puntos cuánticos son tóxicos y necesitan ser encapsulados para prevenir envenenamiento por metales pesados cuando son usados en bioaplicaciones. Un trabajo previo en nuestro laboratorio, detallado en el capítulo 2, encontró un método de síntesis capa-a-capa para obtener nanocebollas, que consisten en varias capas de sílica rellenas con diferentes puntos cuánticos. Esta disposición es muy útil para tener diferentes colores, como si fuesen viales diferentes, confinados en unos pocos nanómetros. La matriz de sílica juega un papel importante para hacer a los puntos cuánticos solubles en agua y proteger su fotoluminiscencia del efecto de apagado, al menos en el rago de pH útil para las aplicaciones viológicas. Cuanto mayor es el grosor de la capa de sílica o mayor el número de capas, mayor es la protección ofrecida a los puntos cuánticos del interior. Basándonos en este principio, mostramos que estas nanocebollas, que nosotros llamamos nanocebollasmulticódigo (Quantum-onion-multicode, QOM), pueden ser usadas como sensor de pH, como se detalla en el capítulo 3. Se ha demostrado que la relación entre la intensidad de fotoluminiscencia entre dos poblaciones de puntos cuánticos se corresponde con el valor de pH del medio, haciendo que nuestro sistema confiera un carácter potencialmente aplicable como sensor ratiométrico de pH. Además, el desarrollo de puntos cuánticos dentro de espferas de sílica como sondas biomoleculares puede dar nuevas percepciones para paliar algunas limitaciones que tienen los puntos cuánticos por sí mismos de forma individual como marcadores biológicos, por ejemplo: mejor fotostabilidad si están dentro de la matriz, mayor superficie disponible para reacciones químicas, mejor capacidad de unión de las esferas, menor toxicidad, y mejor manipulación. Sin embargo, la mayoría de las nanopartículas orgánicas requieren de una funcionalización química con silano, tiol, amino, carboxilo u otros grupos con el fin de otorgarles propiedades aplicables para ser suministradas a células, como son: buena compatibilidad, gran afinidad entre el transportador y la carga, marcaje celular, estabilidad y mayor tiempo de circulación. En el pasado, los hidróxidos de doble capa, también conocidos como materiales tipo hidrotalcita o arcillas aniónicas, han sido la excepción a esta regla. Estos materiales consisten en capas de nanoláminas cargadas positivamente en estructura tipo brucita neutralizada por aniones en el espacio interlaminar. Desde un punto de vista médico, se han publicado muchos cambios interesantes con estos materiales para albergar fármacos y biomoléculas ya sea por intercambio aniónico o por proceso de delaminación-relapilamiento. Este tipo de material has sido usado para transportar puntos cuánticos solubles en agua hechos de teulro de cadmio (capítulo 4) o nanopalos (capítulo 5). Por una parte, las hidrotalcitas intercalan a los puntos cuánticos de teluro de cadmio muy rápido y no se necesitan delaminarse previamente. El material híbrido muestra una alta estabilidad en medio fisiológico a diferentes pH, convirtiéndolo en una herramienta de visualización aplicable para el diagnóstico en nanomedicina. Notoriamente, las propiedades ópticas de los puntos cuánticos sufrieron un salto hacia el azul, atribuido a diferentes factores, como se detalla en el capítulo 4. Sin embargo, este efecto es reversible tras la disolución de la transportador sólido, la hidrotalcita. Con lo que podemos decir que los puntos cuánticos de teluro de cadmio muestran un efecto de memoria óptica. Estas transiciones ópticas se detienen cuando rodeamos los puntos cuánticos de una capa de sílica, preparando puntos cuánticos@silica/hidrotalcita, siendo la capa de sílica una barrera entre las nanopartículas y las arcillas. Esta combinación conduce a una barrera eficiente para los procesos de liberación de puntos cuánticos al medio biológico, tratándose por tanto de un andamiaje inorgánico nanoestructurado que evita toxicidad a la vez que permite una visualización múltiple y un diagnóstico simultáneo en sistemas terapéuticos avanzados. Por otro lado, se prepararon hidrotalcitas cargadas con partículas elongadas luminiscentes de CdSe@CdS, siendo la delaminación el mejor proceso para la carga debido al mayor tamaño de las nanopartículas, como se detalla en el capítulo 5. Este material híbrido resultó tener más luminiscencia y mayor tiempo de vida que cuando estaba cargado con puntos cuánticos, lo que supone una ventaja y un requisito para observaciones in vitro de tiempos prolongados. En consecuencia, se requieren una menor cantidad de nanopartículas y una menor excitación, lo que implica una menor toxicidad o daño a las células. Con estos resultados remarcamos que la combinación de dos campos como son el óptico y el de los nanomateriales, puede crear herramientos potentes para bioaplicaciones. En el capítulo 6, se usan cultivos celulares incubados con los materiales híbridos detallados en los capítulos 4 y 5 para demostrar la utilidad de esta clase de materiales como agentes de visualización. Observamos una dependencia respecto al diámetro de las nanopartículas y la calidad de los resultados, pero se necesitan más pruebas para esclarecer si esta correlación es verdadera o otros factores como la estructura del material transportador están implicados. Finalmente, en el capítulo 7, detallo como, combinando la especificidad de interacciones biomoleculares y la capacidad de calibrado de las propiedades ópticas de puntos cuánticos y fluoróforos, hemos desarrollado por primera vez un sistema in vitro para detectar fibrosis quística tanto de forma cualitativa (1nanoSi) como cuantitativa (2nanoSi). La novedad de nuestro sistema es el uso de procesos de transferencia de energía (FRET), cuyo mecanismo describe como se produce transferencia de energía de un dador (inicialmente en su estado electrónico excitado) y un aceptor a través de un emparejamiento dipolo-dipolo no radiativo. Para que se dé este proceso debe de haber un buen solapamiento entre la emisión del dador y la absorción del aceptor. Además, es un proceso muy dependiente y limitado por la distancia. Hemos anclado un péptido corto previamente marcado con un derivado de rodamina llamado TAMRA a la superficie de las nanoesferas rellenas de un tipo (1nanoSi, rellenas con CdSe540) o dos tipos (2nanoSi, rellanas con CdSe540 y CdSe660, siendo los números las longitudes de emisión) puntos cuánticos. Estas esferas se funcionalizaron con grupos amino para unir los péptidos marcados con TAMRA. Las secuencias de los péptidos diferían en un solo aminoácido: uno tiene prolina y el otro arginina en su lugar. La gente con fibrosis quística tiene mala digestión de péptidos porque los enzimas proteolíticos tienen problemas para llegar al duodeno, que es donde estos enzimas son activos. Elegimos la tripsina como enzima proteolítico por su especificidad de corte, ya que solo corta tras lisina y arginina pero no si estos van seguidos por prolina. Por tanto, en condiciones sanas, la secuencia peptídica sufrirá corte y no se observará FRET en el péptido que no tiene prolina. Al observar los espectros de emisión de los sistemas 1nanoSi vimso que había FRET debido a un buen solapamiento entre la emisión de los puntos cuánticos verdes (CdSe540) y la absorción del fluoróforo TAMRA. Cuando se produce el corte del péptido por la acción de la tripsina, se rompe este proceso de transferencia de energía y la relación entre la fluorescencia entre el dador y el aceptor cambia: el pico del TAMRA decrece mientras que el de los puntos cuánticos verdes aumenta durante la digestión. Pero estos es solo cualitativo, el sistema necesita un tercer componente que no se vea afectado por el FRET para ser cuantitativo. Decidimos usar puntos cuánticos rojos (CdSe660). Ahora nuestro sistema tenia dos capas (2nanoSi), la más interna rellena con puntos cuánticos rojos y la más externa con puntos cuánticos verdes. Tras observar los espectros de emisión vimos que solo cambiaban los picos de los puntos cuánticos verdes y fluoróforo, en cambio el pico de los puntos cuánticos rojos no variaba, lo que significa que solo se producía FRET entre los CdSe540 y el TAMRA. A pesar del pequeño solapamiento entre la emisión del TAMRA y la absorción de los puntos cuánticos rojos, la distancia entre ellos es demasiado grande y no se produce el FRET. Observamos diferentes comportamientos dependiendo de la concentración de tripsina. Usamos la relación entre la intensidad de fluorescencia entre las dos poblaciones de puntos cuánticos como sensor ratiométrico. Dibujando los valores de esta relación de intensidades a través del tiempo obtuvimos las cinéticas de la digestión para diferentes concentraciones de tripsina. A mayor concentración, más rápida era la digestión. La recta patrón resultante de dibujar los valores experimentales de la relación de intensidades I540/I660 para un tiempo de digestión de 10 minutos demostró una buena linearidad que permite determinar la concetración de enzima a niveles clínicamente relevantes para poder diagnosticar la fibrosis quística. En global, estos resultados nos permiten proponer el sistema 2nanoSi como un sensor ratiométrico de fluorescencia y herramienta para calcular la concentración de tripsina, siendo además un método para detectar la fibrosis quítica y otras enfermedades relacionadas con el páncreas fácil de usar, rápido y no invasivo.