Introducing gold nanoparticle bioconjugates within the biological machinery

Abstract

El rápido desarrollo de la Nanotecnología durante las últimas décadas ofrece amplias perspectivas en el uso de materiales a micro- y nanoescala en diferentes áreas de la industria, tecnología y medicina. Sin embargo, su uso y aplicación segura y eficaz en estas áreas requieren un control mucho mayor sobre sus propiedades físico-químicas y sus interacciones moleculares relacionadas con los seres vivos. El conocimiento actual de la comunidad científica está de acuerdo en que existe una brecha considerable en la comprensión de este tipo de interfaz "Nano-Bio". Dando un paso adelante en esta dirección, este trabajo de Tesis ha tenido como objetivo proporcionar conocimientos sobre la formación racional de bioconjugados de nanopartículas de oro para modular y comprender sus interacciones y los procesos celulares. En este contexto, la primera parte de esta Tesis se centra en la síntesis de nanopartículas de oro catiónicas y sus interacciones con células. La primera estrategia desarrollada para la síntesis de nanopartículas de oro cargadas positivamente se llevó a cabo mediante el uso simultáneo de un reductor débil y uno fuerte. Se ha demostrado que los dos reductores actúan de forma secuencial en el proceso sintético para producir nanopartículas de oro catiónicas monodispersas, con tamaños comprendidos entre 10.3 nm y 19.7 nm. Se describe también un método de crecimiento de nanopartículas de oro, en el que se obtienen nanopartículas monodispersas de mayor tamaño (de hasta ~ 28 nm) a partir de nanopartículas de oro previamente sintetizadas, mediante la adición de precursor y un reductor débil. La segunda estrategia desarrollada hace frente a la creciente demanda de nanopartículas de oro catiónicas de diferentes tamaños y ligandos, mediante el empleo de una metodología de transferencia de fase de medio orgánico a acuoso. Esta combinación de métodos de síntesis orgánica y acuosa da como resultado importantes beneficios. Esta estrategia se ha optimizado para preparar nanopartículas de oro catiónicas de 4.6, 8.9 y 13.4 nm de diámetro, usando un ligando alquílico tiolado con carga positiva. Además, su aplicación práctica se demostró mediante la producción de bioconjugados de oro de 13 nm con un péptido catiónico y otro aniónico. Las propiedades físico-químicas de estos bioconjugados en medios de cultivo celular, así como su internalización y toxicidad en fibroblastos humanos han sido estudiados. La segunda parte de esta Tesis se centra en la funcionalización racional de nanopartículas de oro con anticuerpos y la investigación de su interacción específica con receptores celulares. La formación de bioconjugados de oro con anticuerpos se ha estudiado utilizando una química selectiva, que ha permitido controlar el número de anticuerpos y su orientación en la nanopartícula. La obtención de bioconjugados bien definidos hizo posible la creación de nuevos autoensamblajes de nanopartículas mediante reconocimiento anticuerpo-antígeno. Esta estrategia también se exploró para la conjugación de un anticuerpo biológicamente relevante (Cetuximab) con nanopartículas de oro. Bioconjugados de oro con Cetuximab de configuración y multivalencia controlada se han utilizado para examinar su interacción con el receptor de superficie celular EGFR (receptor del factor de crecimiento epidérmico), un receptor de tirosina quinasa que es sobreexpresado en un gran número de cánceres.

The rapid development in Nanotechnology during the past few decades offers wide prospects in using micro- and nanoscale materials in different areas of industry, technology and medicine. However, their safe and efficient use and implementation in such areas require much greater control over their physicochemical properties and their related molecular interactions in living systems. Current knowledge in the scientific community agrees that a considerable gap exists in our understanding of such “Nano-Bio” interface. As a step forward in this direction, this Thesis work aimed to provide insights into the formation of rationally designed gold nanoparticle (Au NP) bioconjugate architectures to modulate and understand cellular interactions and processes. In such a context, the first part of this Thesis is focused on the synthesis of cationic Au NPs and their interactions with cells. A first strategy was developed in which the synthesis of positively charged Au NPs was performed by using simultaneously a weak and a strong reducer. It is shown that both reducers act sequentially in a one-pot synthesis to yield monodisperse cationic Au NPs with sizes comprised between 10.3 nm and 19.7 nm. A two-step seeding growth method is also described in which preformed Au NPs are grown larger (up to ~28 nm in size) by addition of fresh precursor solution and a weak reducer. A second strategy faces the rising demand of cationic Au NPs of different sizes and ligands by employing an organic-aqueous phase transfer methodology. Important benefits resulted from the combination of organic and aqueous synthetic methods. This strategy was optimized to prepare cationic Au NPs of 4.6, 8.9 and 13.4 nm in diameter using a positively charged alkanethiolate ligand. In addition, its practical application was demonstrated by producing ~ 13-nm-in-size cationic and anionic peptide-Au NP bioconjugates. The physicochemical properties of these bioconjugates in cell culture media as well as their uptake and toxicity on human fibroblast cells are discussed. The second part of this Thesis is focused on the rational functionalization of Au NPs with antibodies and investigating their interactions with cellular receptors. A site-directed chemistry was explored to prepare Antibody-Au NP bioconjugates with controlled ratio and orientation of bioconjugation. The formation of well-defined bioconjugates made possible the creation of novel NP-based assemblies using antibody-antigen cross-links. This strategy was also explored for the conjugation of a biologically relevant antibody (Cetuximab) with Au NPs. Cetuximab-Au NP bioconjugates of controlled configuration and multivalency were used to examine their interaction with the cell surface receptor EGFR (epidermal growth factor receptor), a receptor tyrosine kinase overexpressed in a large number of cancers.