Desarrollos metodológicos para el análisis de polimorfismos de los genes del sistema HLA y otros genes, no HLA, predisponentes a enfermedades autoinmunes

Abstract

Las enfermedades autoinmunes son enfermedades multifactoriales donde la genética, el sistema inmune y factores ambientales se encuentran relacionados. En muchas de ellas el Sistema Principal de Histocompatibilidad o HLA juega un papel importante. El HLA es un sistema molecular constituido por un conjunto de proteínas de membrana que son extraordinariamente polimórficas y que, debido a que se encuentran en una misma localización cromosómica con alto desequilibrio de ligamiento, se heredan en haplotipos. Su función principal es la presentación de péptidos a los linfocitos T, definiendo por ello el rechazo en el trasplante alogénico. Como consecuencia de estas características la determinación del polimorfismo HLA (tipificación HLA) es útil en diferentes campos biomédicos. Hay diferentes técnicas que permiten la definición de estos antígenos HLA a diferentes niveles de resolución. Por un lado se encuentran las técnicas de baja-media resolución como son las técnicas serológicas (microlinfocitotoxicidad) u otras basadas en la amplificación de DNA (PCR-SSP, PCR-SSO) y por otro las de alta resolución cuyo gold standard es la secuenciación (PCR-SBT). Esta aproximación junto con las nuevas metodologías de secuenciación (deep sequencing) ha hecho posible resolver los problemas de ambigüedades en la alta resolución. No obstante, en algunas ocasiones no es necesaria una tipificación HLA de alta resolución y por ello no está justificado el uso de una metodología tan costosa, sin embargo las técnicas de baja-media resolución, ampliamente utilizadas en los laboratorios de HLA, también presentan ciertas limitaciones. Este trabajo pretende abordar la complejidad del sistema HLA desde dos puntos de vista; primero explorando la asociación HLA (y otros genes no HLA) y enfermedad, concretamente en el caso de la celiaquía y de la enfermedad de Graves-Basedow y segundo definiendo una metodología de tipificación de baja resolución del locus A del sistema HLA mediante PCR a tiempo real. Para ello, se han puesto a punto técnicas de tipificación de familias de alelos HLA concretos como son HLA-DQ2/DQ8 para el estudio de la celiaquía y HLA-B*08/44 y HLA-C*03/07/16 en el caso de la enfermedad de Graves-Basedow, y en este último además se han estudiado polimorfismos en otros genes no HLA como son CTLA4 (una molécula de coestimulación inhibidora) y PTPN22 (una fosfatasa con funciones también inhibidoras). Con esto se ha pretendido desarrollar un conjunto de pruebas que nos permitan predecir mejor la susceptibilidad a padecer estas enfermedades y ver la correlación con otros parámetros clínicos post-diagnóstico.

Autoimmune diseases are multifactorial diseases where genetics, immune system and environmental factors are related. In many of them the Major Histocompatibility System (or HLA) plays an important role. HLA is a molecular system comprising a set of membrane proteins which are extremely polymorphic and, due to they are in the same chromosomal location with a very high linkage disequilibrium, are inherited in haplotypes. Its main function is the peptide presentation to T cells, thereby defining the allogeneic transplant rejection. As a result of these features, determine the HLA polymorphism (HLA typing) is useful in different biomedical fields. There are different techniques that allow the definition of these HLA antigens at different levels of resolution. On one side, low-medium resolution techniques like serological ones (microlymphocytotoxicity) or those based on DNA amplification (PCR-SSP, PCR-SSO) and in the other side, high resolution techniques, where sequence based typing (PCR-SBT) is the gold standard. This approach together with new sequencing methods (deep sequencing) has made possible to resolve the ambiguity problems in high resolution. However, sometimes a high resolution HLA typing it is not necessary and thus does not justify the use of a very expensive method, but low-medium resolution techniques, widely used in laboratories HLA also exhibit certain limitations. The aim of this work is to study the HLA system complexity from two points of view: first exploring the association HLA (and other non-HLA genes) with disease, particularly in the case of celiac and Graves' disease and second defining a low-resolution technique to HLA-A typing using real time PCR. For this purpose, we have developed different reactions to detect different allele families like HLA-DQ2/DQ8 (related with celiac disease) and HLA-B*08/44 and HLA-C*07/03/16 (in case of Graves' disease). Moreover, in Graves’ disease study there also have been studied polymorphisms in other non-HLA genes such as CTLA4 (costimulatory molecule inhibitor) and PTPN22 (a phosphatase inhibitor also functions). With all of this we have tried to develop a set of tests that allow us to better predict individual disease susceptibility.