Estudis in vivo d’internalització cel•lular de nucleòsids fluorescents

Abstract

Els anàlegs nucleosídics poden ser utilitzats com a fàrmacs anticancerígens i en teràpies antivirals. Les proteïnes encarregades del reconeixement i translocació dels derivats cap a l'interior cel•lular són els transportadors nucleosídics (NTs), els quals es classifiquen en transportadors de nucleósids concentratius (CNTs) i equilibratius (ENTs), i els transportadors de cations orgànics (OCTs). La utilització de compostos marcats radioactivament és habitual en l'estudi de l'activitat d'aquestes proteïnes, tot i que aquest tipus d'assaig no permet l'anàlisi del transport intracel•lular o la distribució dels nucleòsids a l'interior cel•lular. Per aquest motiu, l'objectiu del present treball és l'obtenció d'anàlegs nucleosídics fluorescents que permetin l'estudi de l'activitat dels transportadors CNT i OCT in vivo mitjançant microscòpia confocal de fluorescència.

Els compostos fluorescents triats per a l'estudi s'escullen en funció de la seva estructura (amb modificacions mínimes respecte als nucleòsids naturals) i característiques espectroscòpiques (longitud d'ona mínima d'absorció de 350 nm). Segons aquests criteris es trien cinc anàlegs: pirrolo-Citidina (pirrolo-C), Uridina-furà (U-furà), derivat tricíclic de citidina (tC), derivat de pteridina i anàleg amb un grup benzotiofé. A excepció del primer anàleg (compost comercial), els derivats són sintetitzats i purificats per HPLC. La interacció de les molècules amb les proteïnes CNT i OCT es determina mitjançant la inhibició del transport de [(3)H]Uridina o [(3)H]MPP+ en cèl•lules HeLa transfectades transitòriament. Per altra banda, experiments d'electrofisiologia utilitzant oòcits de Xenapus laevis que expressaven una determinada proteïna CNT permeten avaluar la internalització dels derivats. l'estudi in vivo del transport dels anàlegs fluorescents realitza mitjançant microscòpia confocal de fluorescència amb una longitud d'ona d'excitació de 350 nm.

Els derivats nucleosídícs fluorescents pirrolo-C i U-furà, presenten una forta interacció amb els transportadors hCNT1 i hCNT3, amb unes ICsD de l'ordre baix i inhibeixen significativament l'activitat de hOCT1 i hOCT2. Segons els resultats dels assajos d'electrofisiologia, tant pirrolo-C com U-furà poden ser internalitzats pels dos transportadors concentratíus. El compost tC inhibeix l'activitat tant de hCNT2 com de hCNT3 amb una baixa afinitat, però no indueix corrents de sodi en oòcits en els estudis d'electrofisiologia. Finalment, els derivats de pteridina i benzotiofé no mostren cap tipus d'interacció amb els transportadors. Els experiments in vivo utilitzant microscòpia confocal de fluorescència mostren una clara acumulació intra cel•lular de U-furà i pirrolo-C.

Nucleoside analogues constitute an important class of drugs used in the treatment of hematological malignancies, solid tumors and antiviral therapies. Proteins responsible for the recognition and translocation of nucleoside derivatives into cells are nucleoside transporters (NTs) and organic cation transporters (OCTs). The use of radiolabeled nucleosides is common in the functional analysis these proteins, however, it does not allow real-time in vivo studies of intracellular trafficking and distribution of nucleosides and their metabolites within cells. The development of novel fluorescent nucleoside analogues may allow the measurement of cellular uptake by fluorescence microscopy and can provide a new approach to quantitatively study nucleoside transporter-related functions.

To obtain fluorescent tools to allow the study of concentrative nucleoside transporters (CNTs) and OCTs in vivo, we synthesized fluorescent pyrimidine and purine analogs. We examined its inhibitory effects on transpcrter-mediated uptake of [(3)H]Uridine or [(3)H]MPP+ using transitory transfected HeLa cells. The uptake of analogues for which no radiolabeled forms was evaluated using the two-electrode voltage clamp technique in Xenopus laevis oocytes expressing particular hCNT type proteins. To evaluate the in vivo intracellular uptake of selected derivatives we used confocal microscopy and an excitation wavelength of 350 nm.

Two analogues (uridine and cytidine derivatives) were high-affinity inhibitors of hCNT1 and hCNT3 and partially inhibit the activity of hOCT1 and hOCT2. Additionally, electrophysiology experiments showed that these compounds were hCNT1 and hCNT3 subst rates. A tricyclic oxophenothiazine derivative was a low-affinity inhibitor of hCNT2 and did not induce sodium currents in oocytes in electrophysiology studies. Finally, a guanosine analogue that incorporates one carbonil group in the nucleobase did not show any interaction with hCNTs. In vivo experiments using fluo rescent confocal microscopy showed a clear intracellular accumulation of fluorescent nucleosides in cells expressing hCNT or hOCT proteins. In addition, the uridine analogue showed different accumulation than the cytidine derivative. While the first accumulated along all the experiment, the cytidine analogue showed a progressive decrease in its intracellular accumulation. On the other hand, the oxophenothiazine derivative did not show a different interaction with membrane cells that present CNTs.

In conclusion, in vivo experiments using confocal microscopy demonstrated that both pyrimidine analogues can be used to distinguish cells with or without expression of hCNT1/3 or hOCT1/2. These fluorescent derivatives can provide an excellent tool to quantify concentrative nucleoside transporters in intact cells.