Estudio in vitro de la fisiología del esfínter esofágico inferior y de la motilidad del cuerpo esofágico humano y porcino

Abstract

El objetivo general de esta tesis consistió en el estudio, in vitro (baño de órganos y microelectrodos), de la fisiología del cuerpo esofágico (EB) y del esfínter esofágico inferior (LES) con tejido de dos especies, humana y porcina. Permitiendo: Estudiar los neurotransmisores y mecanismos que controlan las respuestas inducidas por la estimulación de las motoneuronas (MNs) inhibitorias y excitatorias del plexo mientérico (MP) en el esófago (LES y EB) humano y animal. El modelo porcino está considerado como un modelo animal homólogo, ya que ambas especies tienen muchas similitudes tanto funcionales como estructurales respecto al tracto gastrointestinal. El objetivo del primer estudio, fue evaluar el efecto de la estimulación selectiva de las MNs inhibitorias y excitatorias en el LES porcino a través de los receptores nAChRs, 5-HT3 y P2X. Se estudiaron tiras de LES circular, de cerdos adultos, en baño de órganos. Se compararon los efectos de la estimulación de las MNs mediante estimulación eléctrica de campo (EFS:26V, 0.3-20Hz); nicotina (1-300μΜ); 5-HT y 2-Me-5-HT (1nM-30μΜ) y α,β-meATP (1-100μΜ) en tres soluciones: Krebs estándar, solución no-adrenérgica no-nitrérgica no-purinérgica (NANNNP) y solución no-adrenérgica no-colinérgica (NANC). Los resultados sugieren mecanismos selectivos para estimular las vías motoras inhibitoria y excitatoria en el LES porcino. Las MNs inhibitorias se estimulan intensamente mediante los receptores nAChRs y no responden a la estimulación de los receptores 5-HT3 y P2X. Por contra, las MNs excitatorias se estimulan a través de los receptores 5-HT3 y P2X, la estimulación a través de los nAChRs es difícil causando una respuesta débil. El objetivo del segundo estudio, fue explorar los mecanismos mientéricos de control de la motilidad esofágica humana y el efecto de los neurotransmisores nitrérgicos y no-nitrérgicos, mediante tiras esofágicas circulares en baño de órganos y microelectrodos. Se compararon las respuestas obtenidas tras la EFS de las MNs entéricas ó a través de los receptores nAChRs en el cuerpo esofágico (EB) y en las regiones clasp y sling del LES. Los resultados muestran una especialización regional en la estimulación de las MNs entéricas en el esófago humano, con respuestas inhibitorias más intensas en las fibras clasp del LES y respuestas excitatorias colinérgicas más intensas en el EB. Las respuestas inhibitorias están desencadenadas principalmente por las MNs entéricas nitrérgicas que median los potenciales postunión inhibitorios (IJP) en el LES y en el EB, la relajación-on inducida por EFS en las zonas clasp y sling del LES y la latencia en el EB. También se encontró un papel menor para las purinas (a través de receptores P2Y1) y el VIP mediando parte de la relajación no-nitrérgica en la zona clasp del LES. El objetivo del tercer estudio, fue caracterizar los neurotransmisores implicados en el origen y modulación de las contracciones del músculo liso circular del EB porcino. Se estudiaron las respuestas al EFS de las MNs de las tiras de EB en baño de órganos y microelectrodos. Se caracterizó el efecto de los antagonistas de los neurotransmisores inhibitorios (L-NAME 1mM, MRS2179 10μM) y excitatorios (atropine 1μM; SR140333 1μM-NK1ra-, GR94800 1μM-NK2ra-) y gangliónicos (hexamethonium 100μM, ondansetron 1μM, NF279 10μM). Los resultados sugieren que el timing (latencia) y amplitud de las contracciones esofágicas están determinadas por un equilibrio de interacciones complejas entre las MNs inhibitorias y excitatorias. La latencia depende de la activación de las MNs inhibitorias liberando NO y una contribución purinérgica menor a través de receptores P2Y1, y de las MNs excitatorias liberando ACh. La amplitud depende de una contribución principal de las MNs excitatorias liberando ACh y taquiquininas, y también de las MNs inhibitorias liberando NO, ATP o una purina relacionada y neurotransmisores peptidérgicos actuando como fuertes moduladores de la transmisión neuroefectora excitatoria.

The aim of this Doctoral Thesis was to study, in vitro, the physiology of the esophageal body (EB) and the lower esophageal sphincter (LES) with tissue from human and porcine species. To do these we used organ baths and microelectrodes, which have allowed us: To study both the neurotransmitters and the mechanisms that control the responses induced by stimulation of inhibitory and excitatory motorneurons (MNs) of the myenteric plexus (MP) in the human and animal esophagus (LES and EB). The porcine model is considered as a homologous animal model to human, as both species have many functional and structural similarities regarding the gastrointestinal tract. The aim of the first study was to assess the effect of selective stimulation of inhibitory and excitatory MNs in porcine LES through nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs), 5-HT3 and P2X receptors. Circular LES strips from adult pigs were studied in organ baths. We compared the effects of stimulation of MNs by electrical field stimulation (EFS: 26V, 0.3-20Hz); nicotine (1-300μΜ; 5-HT and 2-Me-5-HT (1nM-30μΜ) and α,β-meATP (1-100μΜ) in standard Krebs solution, a non-adrenergic non-nitrergic non-purinergic (NANNNP) solution and a non-adrenergic non-cholinergic (NANC) solution. Our results suggest selective mechanisms for stimulation of intrinsic excitatory and inhibitory motor pathways in porcine LES. Inhibitory MNs are strongly stimulated by nAChRs and do not respond to stimulation of 5-HT3 and P2X receptors. By contrast, excitatory MNs are stimulated through 5-HT3 and P2X receptors, stimulation through nAChRs being difficult and causing a weak response. The aim of the second study was to explore the myenteric mechanisms of control of human esophageal motility and the effect of nitrergic and nonnitrergic neurotransmitters. Human circular esophageal strips were studied in organ baths and with microelectrodes. Responses following electrical field stimulation (EFS) of enteric motorneurons (MNs) or through nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) were compared in the esophageal body (EB) and in clasp and sling regions in the lower esophageal sphincter (LES). Our study shows a regional specialization to stimulation of EMNs in the human esophagus, with stronger inhibitory responses in clasp LES fibers and stronger cholinergic excitatory responses in the EB. Inhibitory responses are mainly triggered by nitrergic enteric MNs mediating the inhibitory junction potentials (IJP) in the LES and EB, EFS on-relaxation in clasp and sling LES sides, and latency in the EB. We also found a minor role for purines (through P2Y1 receptors) and vasoactive intestinal peptide-mediating part of nonnitrergic clasp LES relaxation. The aim of the third study was to characterize the neurotransmitters involved in the origin and modulation of circular smooth muscle esophageal body (EB) contractions in the porcine esophagus. Responses of porcine EB strips to electrical stimulation of motorneurons (MNs) were assessed in organ baths and with microelectrodes. The effect of antagonists of inhibitory (L-NAME 1mM, MRS2179 10μM) and excitatory neurotransmitters (atropine 1μM; SR140333 1μM-NK1ra-, GR94800 1μM-NK2ra-) and of ganglionic neurotransmitters (hexamethonium 100μM, ondansetron 1μM, NF279 10μM) were characterized. Our results suggest that timing (latency) and amplitude of esophageal contractions are determined by a balance of complex interactions between excitatory and inhibitory MNs. Latency depends on the activation of inhibitory MNs releasing NO and a minor purinergic contribution through P2Y1 receptors, and excitatory MNs releasing ACh. Amplitude depends on a major contribution of excitatory MNs releasing ACh and tachykinins, and also on inhibitory MNs releasing NO, ATP or related purines, and peptidergic neurotransmitters acting as strong modulators of the excitatory neuroeffector transmission.