Neural inhibitory mechanisms regulating colonic mechanical activity: role of adenosine triphosphate, nitric oxide and hydrogen sulphide

Abstract

La neurotransmissió inhibitòria participa en el control de l’activitat motora del còlon. Els neurotransmissors inhibitoris hiperpolaritzen la membrana del múscul llis, generant un potencial d'unió inhibitori (”Inhibitory Junction Potential” IJP) que és la base electrofisiològica de la relaxació muscular. Així, l’adenosina trifosfat (ATP), l’òxid nítric (NO) i el sulfur d’hidrogen (H2S) són molècules de senyalització que poden exercir aquest control. L’objectiu d’aquesta tesi doctoral ha estat valorar la participació de l’ATP, el NO i el H2S en la transmissió neuromuscular inhibitòria en el còlon humà i de rata. El hidrogensulfur de sodi (NaHS) va ser utilitzat com font de H2S.

Els antagonistes específics dels receptors P2Y1 van inhibir completament el component purinèrgic de l’IJP en el còlon humà i de rata (rang de potència: MRS2500>MRS2279>MRS2179). El β-NAD va produir hiperpolarització i relaxació de la musculatura del còlon humà. Tanmateix, la relaxació no va ser bloquejada pels antagonistes P2Y1. En el còlon de rata es va observar que l’alliberament de neurotransmissors inhibitoris produïa la generació d’IJP espontanis i un potencial de membrana muscular hiperpolaritzat. Mitjançant MRS2500 es va posar de manifest que els receptors P2Y1 participaven en la gènesi dels IJP espontanis. El Nω-nitro-L-arginina (L-NNA) va permetre establir que l'estat de hiperpolarització tònic del potencial de membrana era d'origen nitrèrgic. L’ús d’apamina, spadina i ODQ va permetre valorar la participació dels canals de potassi de baixa conductància activats per calci (SKCa), els canals de potassi relacionats amb TWIK tipus 1 (TREK1) i la via de la guanilat ciclasa (GC) sobre la neurotransmissió purinèrgica i nitrèrgica. L’apamina va bloquejar tots dos components amb diferents nivells d'afinitat. L’ODQ només va bloquejar la neurotransmissió nitrèrgica. D’altra banda, tot i posar de manifest la presència de canals TREK1 en el còlon de rata, la spadina, un blocador de TREK1, no va bloquejar cap dels components. L’expressió dels enzims de síntesi del H2S es va determinar immunohistoquímicament en l’epiteli, el múscul i les neurones del còlon de rata. A més, es va demostrar que el teixit de rata era capaç de produir enzimàticament H2S. Tot i que en alguns casos es van observar efectes no específics dels inhibidors dels enzims de síntesi del H2S, aquestos van produir despolarització de les cèl·lules musculars i un increment de l’activitat mecànica del còlon. En segments de còlon de rata, el NaHS administrat per serosa va causar un efecte dual sobre els patrons de motilitat. El NaHS va inhibir les contraccions d'alta amplitud, mentre que va incrementar les contraccions de baixa amplitud. El NaHS va inhibir els potencials d'unió excitador i va hiperpolaritzar el múscul. Tanmateix, l’H2S no va alterar el marcapassos colònic situat a nivell del plexe submucós. El NaHS via luminal no va modificar la motilitat del còlon.

La neurotransmissió purinèrgica al còlon humà i de rata es produeix a través del receptor P2Y1. L’ATP i el NO són alliberats per les neurones inhibitòries del plexe mientèric i tenen funcions complementàries en el còlon. D'una banda, l’ATP exerceix una acció fàsica sobre el potencial de membrana i l’activitat mecànica, mentre que el NO té una acció tònica. Ambdues respostes nitrèrgica i purinèrgica son en part sensibles a apamina, suggerint que els canals SKCa poden esta involucrats en les dues vies. El NO exerceix el seu efecte sobre el potencial de membrana a través de l’activació de la via de GC però no activa els canals TREK1. El H2S és produït i alliberat endògenament en el còlon de rata i pot actuar com una molècula de senyalització amb acció moduladora sobre la motilitat colònica. El seu mecanisme d’acció implica una inhibició de la neurotransmissió colinèrgica i hiperpolarització muscular.

Inhibitory neuromuscular transmission is involved in the control of colonic motility. Inhibitory neurotransmitters cause membrane hyperpolarization of smooth muscle, that is, an inhibitory junction potential (IJP) which is the electrophysiological basis of muscle relaxation. Thus, adenosine triphosphate (ATP), nitric oxide (NO) and hydrogen sulphide (H2S) are signalling molecules which can exert this control. The aim of this thesis was to evaluate the role of ATP, NO and H2S in inhibitory neuromuscular transmission in the rat and human colon. Sodium hydrosulphide (NaHS) was used as the source of H2S. Specific P2Y1 receptor antagonists completely inhibited the purinergic component of the IJP in the human and rat colon (potency range: MRS2500> MRS2279> MRS2179). β-NAD produced smooth muscle hyperpolarization and relaxation in the human colon. However, the relaxation was not blocked by P2Y1 antagonists. In the rat colon, it was observed that the release of inhibitory neurotransmitters produced both spontaneous IJP and a sustained muscle hyperpolarization. MRS2500 revealed that P2Y1 receptors were responsible for spontaneous IJP. Nω-nitro-L-arginine (L-NNA) allowed us to establish that the tonic state of muscle hyperpolarization was nitrergic in origin. Apamin, spadin and ODQ were used to assess the involvement of small-conductance calcium-activated potassium channels (SKCa), TWIK-related potassium channels 1 (TREK1) and the guanylate cyclase (GC) pathway on purinergic and nitrergic neuromuscular transmission. Apamin blocked both components with a different relative sensitivity. ODQ only blocked nitrergic neuromuscular transmission. Furthermore, even though the presence of TREK1 channels was revealed in rat colon, none of the components was blocked by spadin, an effective TREK1 channel inhibitor. The expression of H2S-producing enzymes was determined by immunohistochemistry in the epithelium, muscle and nerve cells in the rat colon. In addition, it was demonstrated that the rat tissue was able to enzymatically produce H2S. Although in some cases the effects of H2S-producing enzymes inhibitors were not specific, they caused muscle depolarization and an increase in colonic mechanical activity. In segments of rat colon, NaHS caused a dual effect on motility patterns when administered via serosa. NaHS inhibited propulsive contractions whereas it caused an increase in the amplitude of ripples. NaHS inhibited cholinergic excitatory junction potentials and hyperpolarized smooth muscle cells. However, NaHS did not modify the colonic pacemaker located at the level of the submucosal plexus. Luminal addition of NaHS did not modify motility patterns.

Purinergic neurotransmission in the rat and human colon is mediated by P2Y1 receptors. ATP and NO are released by myenteric plexus inhibitory neurons and have complementary functions in the colon. I.e. ATP produces a phasic action on membrane potential and mechanical activity and NO has a tonic effect. Both purinergic and nitrergic responses are in part apamin sensitive suggesting a possible involvement of SKCa in both pathways. NO effects on membrane potential are produced by GC activation but TREK1 channels are not involved. In the rat colon, H2S is produced and released endogenously and it might be a signalling molecule modulating action on colonic motility. H2S mechanism of action involves inhibition of neurally mediated cholinergic responses and muscle hyperpolarization.