Analisis de la expresión y la función del receptor sensor de calcio en tumores del desarrollo

Abstract

Los neuroblastomas (NB), ganglioneuroblastomas (GNB) y ganglioneuromas (GN) conforman el grupo de los tumores neuroblásticos (TN). Se trata de un grupo muy heterogéneo de tumores del desarrollo que pueden involucionar espontáneamente, desarrollarse como tumores loco-regionales o presentarse como NB metastásicos. Los TN más diferenciados se asocian a presentaciones clínicas de evolución favorable. Nuestro grupo describió que el receptor sensor de calcio (CaR) se encuentra expresado en TN diferenciados y de buen pronóstico, mientras que su expresión es muy reducida en los NB indiferenciados. El receptor sensor de calcio (CaR) es un receptor acoplado a proteínas G que parece ejercer funciones muy diferentes en distintos tipos de cáncer.

En esta tesis, hemos planteado la hipótesis de que CaR ejerza funciones como gen supresor de tumores en el contexto de los TN. Por ello, hemos analizado mecanismos genéticos y epigenéticos potencialmente responsables de la disminución de su expresión en los NB desfavorables y hemos evaluado los efectos derivados de su sobre-expresión y reactivación en líneas celulares de NB en las cuales está silenciado.

Hemos hallado que el gen CaR se halla silenciado mediante mecanismos epigenéticos en líneas celulares de neuroblastoma portadoras de amplificación del oncogén MYCN. Estos mecanismos, que cooperan sinérgicamente para reducir o abolir la expresión del gen CaR en este contexto celular, incluyen la hipermetilación de una isla CpG que engloba al promotor 2 de este gen y la hipoacetilación de las histonas. La hipermetilación de la mencionada isla CpG se halla también presente en neuroblastomas primarios, en asociación con niveles reducidos de expresión del ARNm del gen CaR y factores de mal pronóstico en estos tumores como son la amplificación del oncogén MYCN, estadio clínico 4, edad al diagnóstico superior a 18 meses y clasificación anatomopatológica desfavorable. Hemos identificado además la región concreta de la isla CpG que sería crítica para este silenciamiento mediante hipermetilación.

Por otra parte, hemos hallado que la monosomía del cromosoma 3, donde se localiza el gen humano CaR, es una alteración genética detectable en la práctica totalidad de los tumores neuroblásticos primarios. El porcentaje de núcleos portadores de esta anomalía genética es mayor en los tumores histológicamente más diferenciados y lentamente proliferativos (neuroblastomas en diferenciación, ganglioneuroblastomas y ganglioneuromas).

Además, la sobreexpresión inducida y estable del gen humano CaR en líneas celulares de neuroblastoma en las cuales este gen se halla silenciado mediante hipermetilación de su promotor promueve la disminución de su ritmo de proliferación in vitro. Asimismo, reduce hasta casi abolir su capacidad para formar tumores en ratones inmunodeprimidos. Más aún, la reactivación aguda de este receptor en dichas líneas celulares, induce muerte celular mediante apoptosis, un proceso que es dependiente de la activación de ERK1/2. Así pues, la inactivación epigenética del gen CaR parece ser un mecanismo relevante para la viabilidad, proliferación y tumorigenicidad de las células de neuroblastoma.

Por último, el haplotipo TAC, correspondiente al bloque que conforman 3 variantes genéticas funcionalmente relevantes localizadas en el exón 7 del gen CaR (rs1801725, rs1042636 y rs1801726), se correlaciona estadísticamente con el estadio clínico 4 de neuroblastoma. Más aún, este haplotipo, que incluye una variante genética que promueve disminución de la actividad de CaR (rs1801725) pero no el polimorfismo que induce ganancia de función en este receptor (rs1042636), constituye un factor predictor de pronóstico independiente en tumores neuroblásticos y en neuroblastomas.

En conjunto, los Resultados de esta Tesis apoyan la Hipótesis inicial según la cual el receptor sensor de calcio ejerce funciones propias de un gen supresor de tumores en el contexto de los tumores neuroblásticos y, por ello, se halla silenciado mediante mecanismos genéticos y epigenéticos en neuroblastomas agresivos, de mal pronóstico.

Neuroblastic tumors (NTs) include the neuroblastomas, ganglioneuroblastomas and ganglioneuromas. Clinical behavior of these tumors varies from regression to aggressive growth with metastatic dissemination. Our previous results indicated that the calcium-sensing receptor (CaR) gene is expressed in differentiated, favorable NTs, but it is almost undetectable in unfavorable neuroblastomas. The aim of this work was to analyze genetic and epigenetic mechanisms potentially responsible the downregulation of the CaR gene in NTs and to evaluate the effects promoted by its re-expression and activation.

Hypermethylation of a CpG island encompassing the CaR gene promoter 2 in neuroblastoma cell lines and 25% primary neuroblastomas. Hypermethylation of this region was associated with reduced CaR mRNA expression and several predictors of poor outcome in neuroblastomas, including MYCN amplification. Treatment with 5’aza-2-deoxycitidine (Aza) and/or trichostatin A restored CaR expression in MYCN-amplified cell lines. Following Aza exposure, decreased percentages of methylated CpG sites were observed at the abovementioned region. By interphase fluorescence in situ hybridization, variable percentages of nuclei with monosomy of chromosome 3, where the human CaR gene resides, were observed in >90% of primary NTs of all subgroups. Ectopic overexpression of the CaR in two MYCN-amplified neuroblastoma cell lines in which this gene is silenced by promoter hypermethylation significantly reduced their in vitro proliferation rates and almost abolished their capacity to generate xenografts in immunocompromised mice. Finally, upon acute exposure to calcium, the primary activator of this receptor, CaR-overexpressing neuroblastoma cells underwent apoptosis, a process dependent on sustained activation of ERK1/2.

We have also analyzed three functionally relevant polymorphisms of the CaR (rs1801725, rs1042636 and rs1801726) to assess if genetic variants producing a less active receptor are associated with more aggressive disease course. The tri-locus haplotype TAC, that includes the moderately inactivating variant rs1801725 and absence of the gain-of-function rs1042636 polymorphism, was independently associated with an increased risk of death in the entire cohort (Hazard Ratio = 2.45; 95%CI [1.14 -5.29]; P = 0.022) and also in patients diagnosed with neuroblastomas (Hazard Ratio = 2.74; 95%CI [1.20-6.25]; P = 0.016).

Altogether, our data would be consistent with a tumor suppressor role of the CaR in neuroblastic tumors.