Estudio teórico de formas inusuales y modificadas de los ácidos nucleicos

Abstract

1) Estudio teórico de nucleobases modificadas.

Las modificaciones químicas de ácidos nucleicos tienen una amplia variedad de aplicaciones tanto en clínica, utilizadas como agentes antisentido, así como en el estudio de las estructuras de los propios ácidos nucleicos, las interacciones proteína DNA o en la catálisis de ácidos nucleicos por poner algunos ejemplos. Actualmente se sintetizan cientos de análogos de nucleósidos estándar en laboratorios farmacéuticos, algunos de ellos como, por ejemplo, los análogos de la arabinosa de adenosina y citosina, son útiles como fármacos antivirales o anticancerígenos. La mayoría de los fármacos anticancerígenos actúan inhibiendo la síntesis de DNA de alguna manera si bien es cierto que tienen bastantes efectos secundarios. Sin embargo, la combinación de varios de estos fármacos reduce la resistencia y minimizan la toxicidad. Ejemplos de este tipo de análogos son los antimetabolitos que al ser estructuralmente muy similares a los nucleósidos estándar son capaces de interferir en la producción de los ácidos nucleicos inhibiendo las rutas de síntesis de ácidos nucleicos o incorporándose dentro de la estructura del DNA y el RNA. Una vez que se incorporan al DNA, estos compuestos provocan la terminación de la cadena durante la replicación del DNA y en consecuencia la muerte celular. Existen modificaciones del esqueleto azúcar-fosfato de los oligonucleótidos que mejoran la eficacia en la síntesis de siRNAs controlando la expresión génica en unos casos al bloquear estéricamente la actividad enzimática de las nucleasas, en otros inhibiendo la hibridación del mRNA con la hebra antisentido o incluso favoreciendo la formación de triplexes con secuencias específicas de DNA. Un ejemplo de ello son los fosforotioatos que poseen un átomo de oxígeno no enlazante sustituido por azufre en el enlace fosfodiéster. Éste tipo de modificaciones han demostrado ser resistentes tanto para exo- como endonucleasas aumentando la resistencia en cultivos celulares y en suero. Estudio de las propiedades tautoméricas y reconocimiento de las tiocetotiminas. Las bases sintéticas, una vez introducidas en el DNA, son capaces de inducir cambios conformaciones y alterar la estabilidad induciendo incluso mutaciones o modificando los patrones de reconocimiento. La forma tautomérica que suele suponerse para an álogos de nucleobases estándar es la forma ceto/amino. Sin embargo, la influencia del entorno puede en algunos casos favorecer la existencia de formas teóricamente minoritarias. En este estudio se describen las propiedades tautoméricas de la timina, y la 2- y 4-tiocetotiminas mediante métodos ab initio y la combinación de simulaciones de dinámica molecular y cálculos de energía libre. Los patrones de reconocimiento así como las estabilidades relativas de los tautómeros mayoritarios en diversos entornos fueron identificados. Los resultados teóricos fueron apoyados por los resultados experimentales aportados por el laboratorio del Prof. Dr. Ramón Eritja, y permiten describir las características tautoméricas y de reconocimiento de las tiocetotiminas.

2) Estudio de la influencia de la 6-selenoguanina en diferentes estructuras de DNA.

Los análogos de purinas 6-mercaptopurina y 6-tioguanina se utilizan como agentes inhibidores del metabolismo de los ácidos nucleicos en diversos tipos de leucemias. En este trabajo presentamos una caracterización exhaustiva de la estructura y propiedades de interacción de la 6-selenoguanina, un isóstero de la guanina que introducido en el DNA puede afectar diferencialmente en estructuras de mayor orden del DNA. Mediante cálculos exactos de mecánica cuántica y la combinación de simulaciones de dinámica molecular con métodos de energía libre, hemos evaluado la influencia de la sustitución de la guanina estándar por la 6-selenoguanina en sistemas de doble, triple hebra de DNA así como en la estabilidad de estructuras G-cuádruplex. Finalmente, se aborda el estudio de las propiedades electrónicas de la 6-selenoguanina ya que se ha observado que ciertas modificaciones introducidas en el DNA podrían aumentar la capacidad conductimétrica de estos sistemas.

3) Funcionalización de los extremos 3' de oligos de DNA y RNA con derivados modificados con puentes N-etil-N y uso como inhibidor de 3'-exonucleasas.

Existen ciertas limitaciones en el desarrollo de ácidos nucleicos modificados con aplicaciones clínicas y es que, la vulnerabilidad a la acción de nucleasas, tanto exo- como endonucleasas, limita la vida media de estos oligos en suero. En la actualidad, los fosforotioatos son las modificaciones que generan mayor resistencia aunque presentan la limitación de que un elevado número de los fosfatos del oligo han de ser modificados. En este trabajo presentamos una nueva modificación en el extremo 3’ de los oligos, en la que dos nucleósidos se unen por el lado de la base en lugar de por enlace fosfodiéster que es eliminado en el diseño. Simulaciones de dinámica molecular del complejo molecular con el fragmento Klenow de la polimerasa I de DNA de E. coli y el oligo modificado permiten demostrar la base del diseño racional del dímero modificado. Los estudios estructurales se complementaron con los experimentos realizados por la Dr. Montserrat Terrazas y Adele Alagia del grupo del Prof. Dr. Ramón Eritja. Éstos incluían estudios de digestión por 3’-exonucleasas (fragmento Klenow de la polimerasa I de DNA de E. coli y la fosfodiesterasa de veneno de serpiente) así como experimentos celulares de RNA de interferencia.

4) Estudio de la flexibilidad de ácidos nucleicos de doble cadena.

El estudio de la flexibilidad de los ácidos nucleicos ha sido y sigue siendo un campo actual en efervescencia gracias a la desarrollo de las técnicas de moléculas individuales y a los métodos computacionales como la dinámica molecular. En este estudio se aborda la influencia de la secuencia en la estructura, estabilidad y flexibilidad de moléculas de RNA de doble cadena mediante simulaciones de dinámica molecular. Otro de los objetivos del estudio era comparar los dos campos de fuerza que son mayoritariamente utilizados en el campo de los ácidos nucleicos, AMBER (parm99bsc0) y CHARMM (CHARMM27). Los resultados obtenidos demuestran que la flexibilidad es dependiente de la secuencia pudiendo agrupar los diferentes dinucleótidos en su mayor o menor capacidad para ser deformados. Medidas experimentales como la longitud de la persistencia o la torsión de las dobles hélices de RNA son parámetros moleculares globales que definen la flexibilidad en una escala mayor. Mediante métodos de dinámica esencial, se calcularon los promedios de las entropías intramoleculares de las cuatro secuencias consideradas así como las estimaciones teóricas de la longitud de la persistencia, de la torsión helicoidal y del estiramiento molecular. Además, los resultados del estudio aportan más datos acerca de la diferente flexibilidad que existe entre el DNA y el RNA de doble cadena.

In this thesis quantum mechanics and classical mechanics techniques have been used to study the tautomeric properties of modified nucleobases with potential application to antisense and biotechnology fields. On the other hand, the study of the mechanical properties of double stranded DNA and RNA (dsDNA versus dsRNA) and their sequence dependency have been addressed. In practice, the work has been divided into the following sections: 1.- Theoretical study of sulfur modified thymines. The tautomeric properties of thymine and two thioketoderivatives, 2- and 4-thioketothymines, have been studied by means of accurate ab initio calculations and molecular dynamics simulations coupled with free energy calculations. Previous results suggested that these modifications could stabilize DNA structure at least as good as the natural thymine leading to the fidelity consequences during the replication. Indeed, those results suggested that some minor tautomeric forms could be present in the DNA double stranded environment which would explain the higher stability of certain mismatches. In the light of these results, we explored the impact of thioketothymines by means of both theoretical and experimental studies. 2.- Theoretical study of seleno modified guanine. We explore the chemical properties of 6-selenoguanine (6SeG) and the influence in duplex, triplex and G-quadruplex structures by means of high-level quantum mechanics calculations and free energy calculations combined with molecular dynamics simulations. 6-Selenoguanine, like other related antimetabolites like thiopurines, has been longtime used against several cancers like lymphomas or hepatomas. Moreover, their applications have been extended to solving X-ray nucleic acids structures (6SeG can be incorporated to these molecules and display anomalous dispersion) and, from the present work we suggest that 6SeG can also exhibit remarkable conductor properties in DNA structures. 3.- Inhibition of 3’-exonucleases with dimeric N-ethyl-N modified nucleosides. Development of synthetic oligonucleotides (ONs) has received much attention in the past years due to their ability to silence the expression of undesired overexpressed genes. Among established therapies, siRNAs have been widely studied due to their high potency and sequence-specificity. However, the application of oligonucleotides in vivo faces important limitations. For example, their high vulnerability to degradation by serum nucleases. Much effort has been made to overcome these limitations but, in many cases, modifications that increase nuclease stability, cause negative effects on RNAi activity. We are interested in creating chemical modifications able to increase nuclease stability without disrupting RNAi activity. In particular, in this work, we explored 3’-terminal modifications by replacing standard nucleobases by N-ethyl-N-coupled nucleosides. We focused special attention on 3’-exonucleases because they are the predominant nuclease activity present in serum. By means of molecular dynamics simulations and in vitro experiments, modified siRNAs resistant to nuclease digestion were evaluated against Bcl-2 in vitro, an antiapoptotic gene which is overexpressed in several cancer processes. 4.- Flexibility study of dsRNA molecules. Despite their chemical similarity, DNA and RNA duplex structures play very different biological roles. While double stranded DNA can display a large variety of structures close to the B-form with very dynamic sugar-phosphate conformations, RNA double stranded has been traditionally considered rigid. However, presented results from CHARMM27 MD simulations that pointed in the opposing direction, stating that RNA2 is more flexible than DNA2. To shed some light on this topic, we study the flexibility of double stranded RNA molecules by means of molecular dynamics simulations on four different 18-mer sequences. AMBER and CHARMM nucleic acid force fields were used to analyze the sequence dependent elastic properties and the results were ultimately compared with the obtained for DNA duplex, were both force fields produced comparable results.