Mejora de los modelos preclínicos de tumores cerebrales. Aplicación a la caracterización ex vivo e in vivo de agentes de contraste nanoparticulados para imagen de resonancia magnetica.

Abstract

Los tumores cerebrales afectan a 9 de cada 100.000 adultos en España, observándose una mayor frecuencia de tumores de tipo glial. Estos tumores presentan un importante impacto en la calidad de vida de los pacientes afectados y un mal pronóstico, sobre todo en los tumores de grado alto. La monitorización no invasiva de los tumores cerebrales es muy importante para el diagnóstico y seguimiento de la enfermedad y se hace sobre todo por técnicas de Imagen por Resonancia Magnética (IRM), la cual aporta información morfológica. La Espectroscopía de Resonancia Magnética (ERM), tanto en su modalidad voxel único como imagen espectroscópica (IERM) son técnicas complementarias de gran utilidad, por aportar información del entorno metabólico, que no puede conseguirse mediante la IRM. Las dificultades éticas para desarrollar mejoras en los protocolos de IRM/ERM, así como para la prueba de nuevos agentes de contraste en pacientes humanos han llevado al desarrollo de los modelos murinos de cáncer cerebral. Los modelos más utilizados son los creados por inyección estereotáxica, aunque también se han desarrollado modelos transgénicos (GEM, genetically engineered mice) que desarrollan tumores cerebrales espontáneamente y reproducen las características infiltrativas de tumores humanos. En esta tesis, se llevó a cabo en el capítulo 2 un amplio estudio de caracterización de diferentes colonias GEM. Se comprobó la baja penetrancia de tumores en estos modelos (16,7% en la colonia que mejores resultados produjo), lo que plantea dificultades para realizar estudios con grupos homogéneos. Este hecho, sumado a la escasez de modelos preclínicos de tumores cerebrales de bajo grado actualmente disponibles, motivaron a su vez el estudio que se llevó a cabo en el capítulo 3 de ésta tesis. Dicho capítulo trata del establecimiento de una línea transplantable de tumor cerebral murino de bajo grado a partir de un tumor desarrollado por un animal de la colonia GEM. El objetivo de éste capítulo consistía en generar un tumor inducible mediante inyección estereotáctica intracraneal de gliosferas generadas en cultivo a partir de la disgregación del tumor glial de origen. Se llevó a cabo una puesta a punto con tumores murinos de tipo GL261 y en un siguiente paso, se continúo con el establecimiento y caracterización de la línea transplantable a partir de un oligodendroglioma anaplásico desarrollado por un especimen de la colonia GEM. Esta línea transplantable ha sido ampliamente caracterizada de manera no invasiva mediante IRM/ERM y también mediante estudios de imagen espectroscópica con perturbación del patrón espectral (PE-IERM).Se obtuvieron resultados prometedores, con un 60% de penetrancia del fenotipo tumoral, y manteniendo en la mayoria (1 de 12 analizados por histopatologia) de los casos la misma patología del tumor de origen. Paralelamente, en el último capítulo se realizaron estudios con nuevos agentes de contraste (AC) que actualmente se están desarrollando para IRM con potencial interés para tumores cerebrales y que permitirán superponer información funcional a la información anatómica. Para ello, se ha desarrollado un método de análisis postmortem de estos AC. Dicho método permite no sólo reducir el número de animales utilizados en la experimentación, sino también reducir en 800 veces la cantidad de agente necesaria para estudios preliminares en IRM preclínica. Nuestros resultados preliminares apuntan a que este método es más preciso que los análisis de relajatividad in vitro, debido a una mejor simulación del entorno in vivo y de la posible interacción del AC con tejidos, moléculas y receptores presentes en el entorno de utilización. Los resultados obtenidos con el mejor agente analizado (GNP(E), con un incremento de contraste relativo, IRC, 330% en comparación con contralateral) se han corroborado en un análisis de IRM in vivo en el modelo preclínico de tumor glial GL261 (IRC 122% en comparación con contralateral), siendo a su vez sensiblemente más eficiente que el AC comercial de tipo comparable actualmente disponible y en uso en clínica.

Brain tumors affect 9 out of every 100,000 adults in Spain, being the glial type tumors the most prevalent. These tumors have a significant impact on the quality of life of affected patients and have a poor prognosis, especially the high grade ones. The noninvasive monitoring of brain tumors is important for the diagnosis and follow-up of this disease and it is carried out mainly through magnetic resonance imaging (MRI), which provides morphological information. Magnetic resonance spectroscopy (MRS), both in its single voxel or spectroscopic imaging (MRSI) modalities, is a useful complementary technique for gathering information about the metabolic environment, which is impossible to obtain by MRI.

The ethical restraints for the development of improvements in MRI/MRS protocols, as well as for testing new contrast agents (CA) in human patients, have led to the development of preclinical murine models of brain tumors. The ortothopic models (obtained by stereotactic injection) are the most commonly used, although transgenic models (GEM, genetically engineered mice), that spontaneously develop brain tumors which reproduce infiltrative characteristics of human tumors, have also been developed. In this thesis, a comprehensive study of different GEM colonies characterization was carried out in chapter 2. We have found a low penetrance of brain tumours in those models (16.7% in the best colony), and this makes it difficult to perform studies with homogeneous groups. This fact, coupled with the scarcity of low grade preclinical models of brain tumours currently available, motivated us to perform the study which can be seen in chapter 3 of this Thesis. This chapter describes the development of a transplantable low grade murine brain tumour line originating from a spontaneous tumour developed from a single GEM specimen. The objective for this chapter was to induce a tumour through the intracranial injection of gliospheres which had been cultured after the disaggregation of the originating glial tumour. This procedure was set up using GL261 murine tumours, and the next step was to establish and characterise the transplantable line obtained from an anaplastic oligodendroglioma from the GEM colony. This transplantable line was widely characterized using noninvasive MRI/MRS methods, as well perturbation-enhanced spectroscopic imaging (PE-MRSI). Promising results were obtained, with 60% of tumor phenotype penetrance. In addition, most of the cases (12 out of 12 analyzed by histopathology) retained the same histopathological diagnosis of the original tumour.

Finally, in the last chapter, we performed studies with novel contrast agents (CA) which are currently being developed for MRI and which may be of potential interest for brain tumor studies, and which could allow to gather functional information in addition to the anatomical one. To achieve this goal, a new method using post-mortem analysis was developed for testing the new CA. This method not only allows us to reduce the number of animals used in the experiments, but also reduces (ca. 800 times) the amount of agent required for preliminary studies with preclinical MRI. Our preliminary results suggest that this method is more accurate than in vitro relaxativity analysis, due to a better simulation of the in vivo environment and of the possible interaction of the CA with tissues, molecules and receptors present in the environment studied. The results obtained with the best CA (GNP (E), relative contrast enhancement RCE, 330% in comparison with contralateral brain parenchyma) have been confirmed by in vivo MRI analysis with a preclinical model of GL261 glial tumour (RCE 122% in comparison with contralateral brain parenchyma). This CA was slightly better than a commercially available T1 agent currently being used in clinics.