Las metalotioneínas de mamífero como agentes detoxificadores de plomo(II)

Abstract

El plomo es uno de los metales más nocivos para la salud humana y su incidencia en la misma deber ser tenida en cuenta debido a su amplia distribución en el medio ambiente. El catión Pb(II) interactúa preferentemente con proteínas que contienen Zn(II) (ALAD, CadC, GATA, dedos de Zn) y Ca(II) (CaM, PKC, syt) causando no sólo interferencias en algunos procesos metabólicos (principalmente la biosíntesis de hemoglobina), sino que también inhibe varias enzimas, provocando daños en el sistema nervioso central (SNC). Frente a estos efectos nocivos del Pb(II), los seres vivos han desarrollado mecanismos de defensa y detoxificación, entre los que se encuentran las metalotioneínas. Las metalotioneínas (MTs) son unas proteínas muy versátiles, presentes en la mayoría de organismos, cuyo inusual alto contenido en Cys les confiere una alta capacidad para enlazar metales pesados (Zn(II), Cd(II), Cu(I), Ag(I), Hg(II), Pb(II), etc.), tanto in vivo como in vitro, permitiéndoles actuar como agentes detoxificadores. En base a estos antecedentes y a los estudios desarrollados previamente por este grupo de investigación, en esta Tesis Doctoral se pretende estudiar el posible papel de “Las metalotioneínas de mamífero como agentes detoxificadores de Pb(II)”. Para ello, se estudia la habilidad coordinante de las diferentes isoformas de MTs de mamífero, MT1 y MT2 (ubicuas), MT3 (cerebro) y MT4 (epitelio escamoso estratificado), y de la MT de levadura, Cup1, frente a Pb(II). Simultáneamente, se analizan los factores experimentales (concentración de MT, Tª, pH y tiempo de estabilización) que pueden afectar a dicha coordinación. Estos estudios se han llevado a cabo mediante la utilización de técnicas espectroscópicas (DC y UV-vis), espectrométricas (ESI-TOF MS) y microcalorimétricas (ITC). Además, en este trabajo se ha intentado relacionar el carácter de Zn- o Cu-tioneína de las MTs estudiadas con su capacidad coordinante frente a Pb(II). Por este motivo, se ha incluido el estudio de una Cu-tioneína genuina como es la isoforma Cup1 de levadura. En general, los resultados obtenidos revelan una gran complejidad en la interacción de las MTs de mamífero con Pb(II), de manera que no se pueden hacer extrapolaciones sobre el potencial comportamiento de una determinada isoforma de MT frente a Pb(II) a partir de su carácter de Zn- o Cu-tioneína. Como resultados específicos, se sabe que MT3 es la que presenta una mayor capacidad detoxificadora frente al ión Pb(II) en condiciones similares a las fisiológicas (pH 7.0 y 37 ºC). Adicionalmente, se concluye que, entre los factores experimentales estudiados; el pH, es el que tiene mayor influencia en la formación y estabilidad de las especies Pb-MT. Por otra parte y en relación al carácter de Zn- o Cu-tioneína de las MTs, se ha comprobado que éste no determina completamente la eficacia de la coordinación del ión Pb(II) a la proteína, si bien influye en la manera en que el plomo se coordina a ella.

Lead is one of the major hazards in human health and its impact on it must be taken into account due to its wide distribution in the environment. The Pb(II) cation preferentially interacts with proteins containing Zn(II) (ALAD, CadC, GATA, Zn-fingers) and Ca(II) (CaM, PKC, syt) causing not only interferences in some metabolic processes (mainly the biosynthesis of hemoglobin) but also the inhibition of several enzymes and damages at the central nervous system (CNS). Living organisms have developed defense and detoxification mechanisms against these deleterious effects of Pb(II), among which we can find metallothioneins (MTs). MTs are among the most versatile metal-binding proteins present in all organisms. Their unusually high Cys content confers them a high capacity to chelate heavy metal ions (e.g. Zn(II), Cd(II), Cu(I), Ag(I), Hg(II), Pb(II)), both in vivo and in vitro, allowing them to act as detoxifying agents. Taking into account this background and the previous studies of our research group, in this PhD Thesis we intended to study the possible role of “The mammalian metallothioneins as detoxifying agents for Pb(II)”. To this end, we studied the coordinating ability of the different mammalian MT isoforms, MT1 and MT2 (ubiquitous), MT3 (brain-specific) and MT4 (stratified epithelium) and of yeast, Cup1, tpwards Pb(II). Simultaneously, we analyzed the experimental factors (concentration of MT, T, pH and stabilization time) that may affect such coordination. Spectroscopic (DC, and UV-vis), spectrometric (ESI-TOF MS) and microcalorimetric (ITC) techniques were used. In addition, the Zn or Cu-thionein character of the MTs under study was related to their Pb(II)-binding ability. As a reference, the genuine Cu-tioneína Cup1 from yeast was also studied following the same strategy. Overall, the results show a complex interaction between Pb(II) an each of the mammalian MTs. Therefore, the Pb(II)-binding abilities of a determined mammalian MT isoform cannot be extrapolated from its known Zn- or Cu-thionein character. Turning to specific results, we conclude that MT3 shows the highest Pb(II)-detoxifying capacity under conditions similar to the physiological ones (pH 7.0, 37 ºC). Furthermore, our results lead us to conclude that, among the experimental factors analyzed here, pH shows the highest influence on the formation and stability of the Pb-MT species. Moreover, it has been demonstrated that the Cu- or Zn-thionein character of MTs does not completely determine the efficiency of the Pb(II) coordination to the protein, but that it influences the way in which the lead coordinates to the protein.