Towards gene therapy of inflammatory bowel disease: questions and answers in murine models

Abstract

La Enfermedad Inflamatoria Intestinal (IBD) hace referencia a un grupo de enfermedades de prevalencia creciente que carecen de tratamiento eficaz. Se cree que está causada por pérdida de tolerancia hacia la microbiota en individuos predispuestos genéticamente, resultando en activación de células T, infiltración leucocitaria y producción de mediadores proinflamatorios. En este escenario, la aproximación terapéutica más obvia mediante el uso de terapias biológicas debería ser incrementar la expresión de genes inmunoreguladores, como la IL-10, o bien bloquear los efectos de mediadores pro-inflamatorios, como el TNFα. Ambas aproximaciones podrían ser capaces de limitar la cronificación y empeoramiento de estas patologías. Un gran número de estrategias anti-TNFα se usan actualmente para tratar la IBD, pero ninguna de ellas está libre de efectos adversos y refractariedad. La introducción de ácidos nucleicos en células diana con la intención de aumentar o disminuir la expresión de un gen específico durante un periodo de tiempo prolongado, así como el desarrollo de vectores de terapia génica, eficaces y seguros, se vislumbran como objetivos prioritarios para alcanzar eficacia terapéutica en este tipo de patologías. En este trabajo se analizó el potencial terapéutico de varias estrategias diferentes de terapia génica: por un lado, empleando adenovirus (Ad) defectivos o plásmidos CpG-free, ambos codificantes del gen de la IL-10 y administrados por vía intravenosa (capítulo 1); por otro lado, se emplearon siRNA’s, modificados químicamente o no, para silenciar la citocina proinflamatoria TNFα y administrados por vía intrarectal (capítulo 4). Ambas intervenciones fueron diseñadas para tratar de forma independiente la colitis por DSS en ratones C57BL/6. Además, se estudió la respuesta inmune celular y humoral generada en ratones tras la reexposición a diferentes Ad portadores de transgenes inmunomoduladores (IL-10) o no inmunomoduladores (GFP) (capítulo 2). Asimismo, con el objetivo de encontrar un vector con distribución específica hacia el colon que pudiera ser utilizado para alterar de forma selectiva la expresión génica en éste órgano, analizamos la biodistribución y bioseguridad de diversos adenovirus quiméricos obtenidos de la combinación de elementos del Ad5 -con tropismo hepático- y del Ad40 -con tropismo entérico- (capítulo 3). Estos estudios nos han permitido contrastar la eficacia terapéutica de la sobreexpresión sistémica de IL-10 mediante dos vectores de terapia génica totalmente distintos, y de poner de manifiesto el potencial de las estrategias basadas en la silenciación de TNFα a nivel local como alternativa al bloqueo sistémico de dicha citocina mediante la administración de anticuerpos o receptores solubles. El plásmido CpG-free codificante de la IL-10 fue capaz de producir un importante beneficio terapéutico a corto y medio plazo, sin generar efectos tóxicos, mientras que la toxicidad tardía del Ad5IL-10 administrado por vía sistémica causó un aumento significativo de la mortalidad siendo, por tanto, un gran hándicap para su uso en clínica. El siRNA TNF78 (siTNF78) con la doble modificación O-Metil y propandiol fue capaz de generar una mejora fenotípica en los ratones colíticos, mayor que la de los demás siRNA’s ensayados, en consonancia con su mayor efecto silenciador in vitro e in vivo y con ausencia de efectos inespecíficos (off-target). Paralelamente, nuestro grupo consolidado junto con otros grupos integrantes de IBDnet ha conseguido generar un vector quimérico con tropismo selectivo hacia el colon mediante el reemplazo de proteínas fiber de la cápside del Ad5 por la fiber corta del Ad40. Tras caracterizar la potente respuesta inmune generada in vivo por la administración reiterada del Ad5 y evidenciar el efecto inmunomodulador atribuible a la IL-10 sobre dichas respuestas, proponemos que el uso de IL-10 como transgén en un vector de distribución local (i.e., Ad5/40S) podría ser una alternativa valiosa para el tratamiento de enfermedades intestinales crónicas como la IBD.

Inflammatory bowel disease (IBD) is an increasingly prevalent disorder for which a suitable treatment is still lacking. IBD is thought to be caused by a loss of tolerance to resident enteric bacteria in genetically prone individuals resulting in T cell activation, leukocyte infiltration, and production of pro-inflammatory mediators. In this scenario the most obvious approach of the -so called- biological therapies should be either to increase the expression of immunoregulatory genes, such as IL-10, or to block the effects of proinflammatory mediators, such as TNFα. Both approaches should help overcome the spreading, chronification and worsening of the inflammation. A number of anti-TNFα-based strategies are currently in use for IBD treatment, but any of them is entirely devoid of adverse reactions and refractoriness. The introduction of nucleic acid into target cells in order to increase or decrease the expression of a specific gene during a sustained period of time, as well as the development of efficacious and safe gene therapy vectors are sought as primary objectives to reach therapeutic efficacy in such diseases. The aim of this work was to assess the therapeutic potential of different gene therapy strategies: in one hand, employing a defective adenovirus (Ad) or CpG-free plasmids, both encoding the murine IL-10 cytokine and given by the intravenous route (chapter 1); in the other hand, employing chemically modified or not modified siRNAs to silence the proinflammatory TNFα cytokine and given by the intrarectal route (chapter 4). Both interventions were designed to treat the murine DSS colitis in C57BL/6 mice, independently. Also, the cellular and humoral immune responses generated after repetitive administrations of different Ad encoding immunoregulatory (IL-10) or not immunoregulatory (GFP) transgenes were studied in mice (chapter 2). In order to find a vector with specific colonic biodistribution to selectively alter the gene expression in this tissue, we analyzed the biodistribution and biosafety of several chimeric Ad obtained from combinations of Ad5 -with hepatic tropism- and Ad40 -with enteric tropism- elements (chapter 3). These studies allowed us to compare the therapeutic efficacy of systemic IL-10 up-regulation obtained with two totally different gene therapy vectors, and to evidence the potential of local TNFα-silencing strategies as an alternative to the systemic blockade of this cytokine after administration of monoclonal antibodies or soluble receptors. The CpG-free plasmid encoding the IL-10 gene was able to produce an important therapeutic efficacy without adverse effects at short- and mid-term time points. On the contrary, late toxicity generated after i.v. Ad5IL-10 administration caused a significant increase in the mortality rate, being therefore a short-coming for its clinical application. The siRNA TNF78 (siTNF78) with the double O-Methyl and propanediol modifications was able to induce an important phenotypic amelioration in colitic mice, higher than that of the rest of siRNAs assayed, accordingly with its increased silencing potential both in vitro and in vivo and with the absence of unwanted unspecific off-target effects. The change of the Ad5 fiber with the Ad40 short fiber has allowed our consolidated group and other members of IBDnet to generate a chimeric Ad5/40S with selective tropism for the colon. After the characterization of the potent immune response generated after repetitive administration of Ad5 in vivo as well as the confirmation of the immunomodulatory effects exerted by the IL-10 transgene in these responses, we suggest the use of IL-10 as transgene in a gene therapy vector with local biodistribution (i.e., Ad5/40S) as a promising alternative for the treatment of chronic intestinal diseases such as IBD.