Identification and partial characterization of acid phosphatases from Haemophilus parasuis

Abstract

Haemophilus parasuis es una bacteria Gram negativa común en el tracto respiratorio superior de cerdos sanos y es el agente etiológico de la enfermedad de Glässer, que se caracteriza por poliserositis fibrinosa y poliartritis. En los últimos años, la prevalencia de las infecciones respiratorias, incluyendo la producida por H. parasuis, ha aumentado debido a prácticas de manejo de los animales, como el destete precoz, y a la aparición de virus inmunosupresores. Poco se sabe acerca de la patogénesis y los factores de virulencia de H. parasuis y esto complica el control de la enfermedad. Las fosfatasas ácidas son ubicuas en organismos eucariotas y procariotas y han recibido mucha atención con la finalidad de entender sus estructuras, funciones y mecanismos catalíticos. En bacterias Gram negativas estos enzimas tienen un papel esencial en numerosos procesos, incluyendo la patogénesis bacteriana. Resultados previos de nuestro grupo demostraron la presencia de fosfatasa ácida secretada en sobrenadantes de ciertas cepas de H. parasuis. De especial interés fue la observación de que la secreción de la fosfatasa se perdía tras pases de la bacteria en el laboratorio, indicando un papel de este enzima en la infección. Por lo tanto el objetivo principal de esta tesis fue identificar y caracterizar los genes responsables de esta actividad fosfatasa. El análisis de una genoteca de la cepa virulenta H. parasuis ER-6P permitió la identificación de 2 clones con actividad fosfatasa. Estos clones contenían los genes aphA y pgpB, respectivamente. El clonaje y análisis posterior de estos genes confirmó que codificaban dos fosfatasas. Específicamente, AphA muestra características típicas de fosfatasas ácidas bacterianas de clase B, incluyendo el dominio catalítico típico (motivo F-D-I-D-D-TV-L-F-S-S-P, localizado en el N-terminal y el motivo Y-G-D-[AS]-D-X-D-[IV] localizado cerca del C-terminal), un peso molecular teo rico de 24,33 KDa e inhibicio n por EDTA. Las fosfatasas ácidas bacterianas de clase B son un grupo de enzimas que forman homotetra meros y esta n presentes en una minorí a de bacterias, que incluye pato genos importantes. Por otro lado, PgpB es una fosfatasa de fosfatidilglicerofosfato, con seis dominios transmembrana, que pueden explicar su localización celular en la bacteria. Ambas proteínas, AphA y PgpB, mostraron un pH óptimo distinto que la actividad fosfatasa secretada por H. parasuis al sobrenadante. En un intento de purificar la fosfatasa secretada, sobrenadantes de H. parasuis fueron fraccionado por cromatografía de flujo por tamaño y las fracciones con actividad fosfatasa fueron analizadas por SDS-PAGE y MALDI-TOF-TOF. La proteína hipotética HPS_05483 se identificó en las fracciones con actividad fosfatasa, pero su expresión nativa recombinante no fue posible. Sin embargo, sí pudo ser purificada con una cola de His y se detectaron anticuerpos frente a ella en cerdos infectados, indicando que ésta proteína se expresa durante la infección. Se produjeron anticuerpos monoclonales (Acm) frente a un sobrenadante de H. parasuis con actividad fosfatasa y una selección inicial detectó Acm frente a Apha. Sin embargo, se debe realizar una selección más exhaustiva de los hibridomas para identificar Acm específicos frente a la fosfatasa del sobrenadante de H. parasuis. Finalmente, se estudió el efecto de sobrenadantes con actividad fosfatasa sobre los macrófagos. La expresión de marcadores de superficie de macrófagos alveolares CD163, SLAI, SLAII, sialoadhesina y SWC3 no se vio afectada por incubación con sobrenadantes de H. parasuis o sobrenadante de un clon que secretaba AphA. En conclusión, hemos identificado y caracterizado parcialmente dos fosfatasas de H. parasuis, AphA y PgpB. Sin embargo, más estudios son necesarios para determinar si la proteína hipotética HPS_05483 es realmente una fosfatasa. El papel de estos enzimas en la biología de H. parasuis debería ser estudiado en más profundidad.

The Gram-negative bacterium Haemophilus parasuis is common in the upper respiratory tract of healthy swine and is the etiological agent of Glässer´s disease, which is characterized by fibrinous polyserositis and polyarthritis. In the last few years the prevalence of respiratory infections, including those by H. parasuis, has increased due to management practices, as early weaning, and the emergence of immunosuppressive viruses. Little is known about the pathogenesis and virulence factors of H. parasuis and this complicates the control of the disease. Acid phosphatases are ubiquitous in eukaryotic and prokaryotic organisms and much attention has been given to these enzymes in order to understand their structures, functions, and catalytic mechanisms. In many Gram-negative bacteria these enzymes have been determined to play a critical role in numerous processes, including pathogenesis. Previous results by our group showed the presence of a secreted acid phosphatase in the culture supernatant of some strains of H. parasuis. Interestingly, the secretion of the phosphatase activity was lost after passages of the bacteria in the laboratory, indicating a role of this enzyme in the infection. Therefore the main objective of this thesis was to identify and characterize the genes responsible for this secreted phosphatase activity. Screening of a genomic library from the virulent strain ER-6P of H. parasuis identified 2 clones with phosphatase activity. These clones contained genes aphA and pgpB, respectively. The subsequent cloning and analysis of the genes demonstrated that their products were in fact phosphatases. Specifically, AphA presented characteristics of bacterial class B acid phosphatases, including the typical catalytic domain (motif F-D-I-D-D-TV-L-F-S-S-P, located in the N-terminal moiety, and Y-G-D-[AS]-D-X-D-[IV] located near the C-terminus), a predicted molecular weight of 24.33 KDa and inhibition by EDTA. Bacterial class B acid phosphatases are a group of homotetrameric enzymes, which are present in a minority of bacteria, most of which are important pathogens. PgpB is a phosphatidylglycerophosphate phosphatase, with six transmembrane domains in the predicted protein, which would explain its location in the bacterial cell. Both proteins, AphA and PgpB, showed a different optimal pH than the activity secreted by H. parasuis into the supernatant. In an attempt to purify the phosphatase from the H. parasuis supernatant, a size exclusion chromatography was performed and fractions with phosphatase activity were analyzed by SDS-PAGE and MALDI-TOF-TOF. A hypothetical protein HPS_05483 was identified in the fractions with phosphatase activity, but cloning and native expression of the gene was not achieved. However, the protein HPS_05483 was purified as a His-tagged protein and antibodies in infected pigs were detected against it, indicating that this protein is expressed during infection. Monoclonal antibodies (mAb) were produced against a phosphatase-positive supernatant from H. parasuis and an initial screening of the mAb identified several hybridomas with reaction against AphA. Further screenings are needed to identify mAb against the secreted phosphatase found in the supernatant of H. parasuis. Finally, the effect of the phosphatase-positive supernatant on porcine alveolar macrophages was studied. The level of macrophage surface markers CD163, SLAI, SLAII, sialoadhesin and SWC3 was not affected by incubation with supernatants from H. parasuis or supernatant from a clone secreting AphA. In conclusion, we have identified and partially characterize 2 phosphatases of H. parasuis, AphA and PgpB. More studies are needed to determine if the hypothetical protein HPS_05483 is in fact a phosphatase. The role of these enzymatic activities in the biology of H. parasuis needs to be further studied.