Regulació de la Brain-specific Kinase 1 (BRSK1) neuronal per sulfàtid i modificacions post-traduccionals

Abstract

Les Brain Specific Kinase 1 i 2 (BRSK1 i 2), també conegudes com a SAD quinases, són proteïnes Ser/Thr quinases de la família de les AMPK-related kinases. Les BRSKs són activades per fosforilació directa de la quinasa màster LKB1 en un residu conservat del loop d’activació o T-loop (Thr189 per BRSK1 i Thr174 per BRSK2). Les BRSKs presenten un domini quinasa a l’extrem N-terminal seguit d’un domini d’unió a ubiquitines (UBA) i una cua a l’extrem Cterminal sense dominis funcionals identificables. Aquestes quinases s’expressen majoritàriament al sistema nerviós, on regulen la polarització neuronal, la sinaptogènesis i l’alliberament de neurotransmissors. Malgrat això, els mecanismes implicats en la regulació d’aquestes quinases no han estat descrits. En aquest treball, mitjançant fraccionament subcel·lular i tinció immunocitoquímica, demostrem en diferents tipus cel·lulars que una fracció de BRSK1 localitza en membranes i que és resistent a l’extracció pel detergent Triton X-100. A més, utilitzant sinaptosomes de cervell de rata, demostrem la presència de BRSK1, però no de BRSK2, en microdominis de membrana lipid raft. Amb l’objectiu de determinar el mecanisme d’associació a la membrana, s’ha observat en extractes de cervell de rata que BRSK1, a diferència de BRSK2, està palmitoilada. La palmitoilació és una modificació post-traduccional en la que un residu de cisteïna es modifica covalentment per palmitat. Malgrat que s’han generat diferents els mutants individuals i combinacions de tots els residus de cisteïna, no s’ha identificat el/s residu/s modificats per palmitoilació. Estudis previs d’activitat quinasa realitzats al laboratori mostren que la incubació de BRSK1 amb vesícules generades amb els lípids dels lipid rafts resulta en un augment de l’activitat quinasa, el que suggereix que BRSK1 podria interaccionar amb algun dels lípids presents a lipid rafts. Mitjançant assajos de lipid-protein overlay assay i d’unió a liposomes, hem observat que BRSK1 uneix específicament la sulfogalactosilceramida sulfàtid. A més, liposomes que contenen sulfàtid activen a la BRSK1 in vitro, el que representa un nou mecanisme d’activació de BRSK1, possiblement al·lostèric. La generació de mutants de deleció de BRSK1 que codifiquen per diferents dominis i regions, ha permès la identificació de la regió de la cua C-terminal anomenada short conserved region 2 (SCR2, responsable de la localització puntuada de BRSK1 en neurones), com la principal regió d’unió al sulfàtid. D’altra banda, hem observat que BRSK1 està ubiquitinada in vivo en assajos en cèl·lules tractades amb l’inhibidor del proteosoma MG-132. Després de considerar diferents E3 ubiquitina lligases implicades en la polarització neuronal (Trim2 i Smurf1/2), hem determinat en cèl·lules en cultiu que Smurf1 interacciona amb BRSK1 i la ubiquitina. Aquesta observació ha estat corroborada mitjançant estudis d’ubiquitinació in vitro amb les proteïnes purificades, on també s’ha comprovat que la poliubiquitinació de BRSK1 per Smurf1 no genera ramificacions d’ubiquitina a través de les Lys 48 i 63. D’altra banda, la ubiquitinació de BRSK1 per Smurf1 és de tipus degradatiu, ja que la sobreexpressió de la lligasa salvatge, però no la inactiva, resulta en una disminució dels nivells de la BRSK1 cel·lular. Smurf1 indueix la degradació específica de proteïnes implicades el establiment de la polaritat neuronal. En neurones no diferenciades Smurf1 ubiquitina i promou la degradació de proteïnes pro-polaritzants, com Par6. En resposta a augments de AMPc, la proteïna kinasa A (PKA) fosforila Smurf1 a la Thr306, promovent la degradació de proteïnes que inhibeixen el creixement axonal a la neurita que esdevindrà axó. En aquest treball demostrem que la forma no fosforilada d’Smurf1 ubiquitina BRSK1 i en promou la seva degradació, mentre que la fosforilació d’Smurf1 per PKA impedeix aquesta degradació. Ja que hem descrit un augment en els nivells de BRSK1 als primers estadis de la diferenciació neuronal, els nostres resultats suggereixen un mecanisme de regulació de la expressió BRSK1 controlat per Smurf1 durant l’establiment de l’eix axó-dendrita, com el descrit per Par6.

Brain Specific Kinases 1 and 2 (BRSK1 and 2, also known as SAD kinases) are members of the family of AMPK-related Ser/Thr protein kinases. BRSKs are activated by the master kinase LKB1, thorough the phosphorylation of a threonine residue (T189 for BRSK1, T174 for BRSK2) within the activation loop of the kinase domain. BRSKs have a kinase domain located at the N-terminal, followed by an ubiquitin-binding domain (UBA) and a C-terminal tail with no identifiable functional domains. The BRSKs are mainly expressed at the nervous system, where regulate neuronal polarization, synaptogenesis and neurotransmitter release. However, the mechanisms remain to be described. Here, using subcellular fractionation and immunocytochemical staining of different cultured cells, we show a pool of cellular BRSK1 that localizes at the membrane, which is resistant to Triton X-100 solubilization. We also show that BRSK1, but not BRSK2, a) associates to lipid rafts microdomains; and b) is palmitoylated. Palmitoylation is the post-translational modification in which the palmitic acid is covalently attached to a cysteine residue. In spite of generating different BRSK1 mutants in which single or several cysteines were mutated, we have not been able to identify primary Cys residue/s palmitoylated. Previous studies carried out in our laboratory showed that liposomes generated with lipids extracted from raft fractions enhance BRSK1 kinase activity, suggesting that BRSK1 could interact with any of the lipids present in lipid rafts. Using lipid-protein overlay and liposomebinding assays, we show that BRSK specifically interacts with the galactosylceramide sulfatide. Furthermore, sulfatide-containing liposomes specifically enhance BRSK1 activity in vitro, underpinning that interaction with sulfatide represents a new, allosteric mechanism of BRSK1 activity modulation, additional to T-loop phosphorylation. Generation of BRSK1 deletion mutants of different regions and domains allowed the identification of the short conserved region 2 (SCR2, located at the C-tem tail and responsible for the punctuate pattern of neuronal BRSK1) as the main region involved in the binding of sulfatide to BRSK1. We found that BRSK1 is ubiquitylated in cells treated with the proteasome inhibitor MG-132. After studying the E3 ubiquitin ligases which regulate neuronal polarization (Trim2 and Smurf1/2), we show in cultured cells that Smurf1 interacts with and ubiquitylates BRSK1. This observation was confirmed by in vitro ubiquitylation assays, using purified proteins, and allowed to determine that Smurf1-mediated ubiquitylation of BRSK1 does not results in Lys-48 or Lys-63 polyubiquitin branches. On the other hand, Smurf1-mediated BRSK1 ubiquitylation leads to BRSK1 degradation, since over-expression of wild type Smurf, but not of the inactive protein, results in a drastic reduction of cellular BRSK1 expression levels. Smurf1 induces specific degradation of proteins which control neuronal polarization. In undifferentiated neurons, Smurf1 ubiquitylates and promotes degradation of pro-polarization proteins, such Par6. In response to an increase on cAMP, protein kinase A (PKA) phosphorylates Smurf1 at Thr306, inducing the degradation of the proteins that inhibit axonal growth in the neurite that will become an axon. Here we show that a non-phosphorylatable form of Smurf1 ubiquitylates and promotes BRSK1 degradation, while PKA-mediated Smurf1 phosphorylation prevents BRSK1 degradation. Since we have shown increasing BRSK1 expression levels during the early stages of neuronal differentiation, our results suggest that Smurf1 might control BRSK1 expression during neuronal polarization, as it does for Par6.