Estudi del mecanisme catalític de les glicosiltransferases que operen amb retenció de configuració

Abstract

Estudis previs basats en l’alineament de seqüències, la predicció d’estructures i la superposició d’estructures resoltes, han demostrat que les glicogen sintases (GSs) d’animals i fongs de la família 3 de les glicosiltransferases (GTs), i les GSs de bacteris i midó sintases de plantes, membres de la família 5 de les GTs, tenen en comú un conjunt de característiques estructurals que fan suposar que tots aquests enzims operen a través d’un mecanisme catalític molt similar. Mentre que el mecanisme de desplaçament directe proposat per a les GTs que operen amb inversió de configuració ha obtingut suport experimental i teòric, el mecanisme catalític de les GTs que operen amb retenció de configuració no està gens clar i, fins al moment, diferents autors han arribat a proposar diversos mecanismes diferents, però cap d’ells ha obtingut alhora suport experimental i teòric, quedant moltes qüestions pendents per resoldre.

Per obtenir més informació referent al mecanisme catalític de les GTs que operen amb retenció de configuració, en aquesta tesi és van seguir dues estratègies. Primerament, a partir de la co-cristal•lització de l’enzim glicogen sintasa de Pyrococcus abyssi (PaGS) amb UDP-glucosa com a donador de glicosil, en absència de substrat acceptor, es va observar que l’enzim descomponia el substrat donador. En aquesta tesi es s’ha identificar el producte obtingut en el centre actiu que és una molècula de d’1,5-anhidro-D-arabino-hexa-1-enitol que tautomeritza cap a la forma més estable 1,5-anhidro-D-fructosa. Malauradament, no s’ha pogut demostrar la competència catalítica de la 1,5-anhidrofuctosa com a intermedi de la reacció de transferència glicosil catalitzada per PaGS (família GT-5) i la glicogenina de múscul de conill (GGN, família GT-8).

Una de les estratègies utilitzades per poder trobar evidències sobre el mecanisme catalític dels enzims, es fer ús de compostos que puguin unir-se de manera no covalent als centres actius i a la vegada no siguin fàcilment degradables pels enzims. Per tal de poder obtenir estructures tridimensionals de complexes ternaris que ens permetin descriure la geometria del centre actiu en el procés catalític. Però actualment hi ha escassos inhibidors de glicosiltransferases que compleixin aquestes característiques. Per aquest motiu, en la segona estratègia d’aquesta tesi, es van estudiar compostos glicomimetics i pseudosucres com a plausibles inhibidors de GTs que operen amb retenció de configuració i, posteriorment, es van determinar els mecanismes cinètics d’inhibició.

A més, estàvem especialment interessats en identificar inhibidors de dues glicosiltransferases: la glicogen sintasa i la glicogen fosforilasa de mamífer. S’ha descrit la glicogen sintasa com un enzim clau en certes malalties causades pel mal funcionament del metabolisme de glicogen i, en particular, en aquelles on es produeix una acumulació de glicogen aberrant en les neurones. D’altra banda, la glicogen fosforilasa també s’ha proposat com a enzim diana per combatre la diabetis mellitus no dependent d’insulina o tipus 2 (NIDDM). Per aquesta part de la tesi és va decidir treballar amb la glicogen fosforilasa de múscul de conill a (RMGPa, família GT-35) com a model de GT de tipus no-Leloir que utilitza glicogen com a substrat acceptor, la glicogen sintasa d’Escherichia coli (EcGS, família GT-5) com a model de GT tipus Leloir que també utilitza glicogen com a substrat acceptor i, finalment, la isoforma 4 de la sacarosa sintasa (SuSy 4) de Solanum Tuberosum L. (família GT-4) com un altre model de GT tipus Leloir que enlloc d’utilitzar un polímer com a substrat acceptor fa ús d’una molècula de fructosa, un monosacàrid, en la direcció de síntesi de sacarosa.