Structural and molecular analysis of arteriolar annuli in the retina: implications in diabetic and hypertensive retinopathy

Abstract

La vasculatura de la retina presenta características especiales ya que es fundamental que los vasos no interfieran el paso de la luz, que debe atravesar la retina para llegar a los fotoreceptores. El pequeño calibre de los capilares retinianos, junto con los elevados requerimientos metabólicos, hace que la regulación del flujo sanguíneo sea fundamental para el correcto mantenimiento de la homeostasis de la retina. La vasculatura retiniana no presenta inervación, por lo que la influencia de estimulación por parte del sistema nervioso autónomo queda excluida. Además, la barrera hematorretiniana aísla a la retina del efecto tanto de hormonas circulantes como de neurotransmisores. Por lo tanto, la función de la vasculatura retiniana debe efectuarse a través mecanismos locales de regulación del flujo. Los anillos arteriolares son estructuras singulares que aparecen en las ramificaciones laterales de las arteriolas de la retina. Dichas estructuras fueron definidas a mediados del siglo pasado por la presencia de acúmulos de material PAS positivo junto con un aumento de la celularidad. Estudios recientes, evidencian, además, la expresión especifica de ciertos genes en dichas ramificaciones. De todos modos, la mayoría de los estudios que versan sobre el anillo arteriolar son antiguos e incompletos. Por lo tanto, tanto la estructura como la función de los anillos aun deben ser elucidadas. Nuestros resultados han confirmado la presencia los anillos arteriolares en la retina del ratón, en la que aparecen como una estructura cónica e hipercelular de material intensamente teñido mediante PAS. La unión especifica de lectinas, junto con la digestión con amilasa salivar, han determinado que esta tinción especifica con PAS se debe a un incremento del contenido en glucógeno en la células que forman el anillo arteriolar. El profundo análisis morfológico del anillo arteriolar evidenció tres componentes distintos en su estructura: las células endoteliales, las células intersticiales (ICs) y las células musculares lisas. Cada uno de estos componentes presentó un fenotipo estructural y molecular distintivo. De este modo, las células endoteliales mostraron una disminución de la expresión de CD31, junto con un incremento en las expresiones tanto de NADPH diaforasa como del factor de von Willebrand (vWF). Por lo tanto, estos resultados sugieren que las células endoteliales del anillo arteriolar son capaces de inducir vasodilatación así como de mantener un ambiente antitrombótico. En el anillo arteriolar, las células musculares lisas presentaron un cambio en la orientación para abrazar el origen de la arteriola colateral. Esta disposición particular podría indicar una actividad de tipo esfínter mediante un abultamiento de las células del anillo hacia el interior de la luz vascular. Además, el análisis ultraestructural evidenció la existencia de uniones de tipo peg-and-socket entre las células musculares lisas del anillo arteriolar. Este resultado sugiere una contracción del anillo arteriolar coordinada mediante tracción. Asimismo, el incremento de expresión de los principales componentes de la membrana basal, colágeno IV, laminina y fibronectina, evidenció un posible refuerzo de esta. Del mismo modo, una disminución en la colocalización entre colágeno IV y laminina sugiere un cambio en la organización de la membrana basal en el anillo arterial. Las ICs se describen como una nueva población celular en el anillo arteriolar. La morfológía de estas células concordó completamente con el “estándar de oro” de características ultraestructurales establecido para la identificación de las células intersticiales de Cajal. Más aun, las presuntas células intersticiales de Cajal encontradas en el anillo expresaron marcadores específicos de éstas tales como Ano1 y CD44, pese a que la expresión de c-kit nunca se observó. El patrón diferencial en la distribución de los filamentos de F-actina, junto con el incremento en la expresión de -actina y la falta de - SMA, permitieron diferenciar de forma más evidente las ICs de las células musculares lisas en el anillo arteriolar. Los estudios funcionales han sugerido que las ICs del anillo arteriolar llevan a cabo funciones de actividad marcapasos, neuromodulación y mecanotransducción. La alteración del flujo sanguíneo es un evento temprano en enfermedades de la retina como la retinopatía diabética y la retinopatía hipertensa, las mayores causas de ceguera y déficit visual en el mundo. Por lo tanto, la función del anillo arteriolar, así como sus alteraciones durante la retinopatía, pueden ser de interés para el discernimiento de la patofisiología de las retinopatías vasculares. El análisis de los anillos arteriolares en un modelo de diabetes tipo 2 (el ratón db/db) evidenció una alteración en el almacenamiento de glucógeno en las ICs del anillo arteriolar. Además, los estudios en un modelo de hipertensión (el ratón transgénico KAP) mostraron un decremento en la expresión de Ano1 en las ICs durante la retinopatía hipertensa, sugierendo una pérdida de función de los canales de cloro activados por calcio. Por lo tanto, las alteraciones observadas en las ICs podrían producir una pérdida de funcionalidad del anillo arteriolar que conduciría a una alteración en la regulación del flujo sanguíneo durante la retinopatía. Los anillos arteriolares también se han encontrado en la retina humana. Estudios preliminares sugieren que, del mismo modo que ocurre en el ratón, estas estructuras se alteran durante la retinopatía. En conjunto, los resultados obtenidos sugieren que el anillo arteriolar está dotado de características moleculares, estructurales y funcionales que le confieren un papel clave en la regulación del flujo sanguíneo tanto en condiciones fisiológicas como durante la retinopatía.

Retinal vasculature shows special characteristics in order to minimize the interference with the light path, which passes through the entire retina to reach the external segment of photoreceptors. The small size and sparse distribution of retinal capillaries, together with the high metabolic demand, makes retinal homeostasis highly dependent on blood flow regulation. Retinal blood vessels are not innervated. Thereby, the influence of autonomic nerve stimulation can be excluded. In addition, blood-retinal barrier isolates the retina from the effect of circulating hormones and neurotransmitters. Thus, for its function retinal vasculature must be controlled through finely tuned local regulatory blood flow mechanisms. Arteriolar annuli are singular structures occurring at side-arm branching sites of retinal arterioles. These structures were defined in the mid last century by the presence of increased PAS-positive material and increased cellularity. Moreover, a recent study has evidenced the specific expression of certain genes at the arteriolar branching points. However, most of the studies dealing with arteriolar annuli are out of date and incomplete. Thus, both structure and function remain to be elucidated. Our results have confirmed the presence of arteriolar annuli in mouse retina, appearing as a conical hypercellular structure of intensely PAS stained material. Lectin specific binding and salivary amylase digestion have determined that specific PAS stain is mainly due to increased glycogen content in cells forming the arteriolar annuli. Detailed morphological analyses of arteriolar annuli have evidenced three different components: endothelial, intersticial (ICs) and smooth muscle cells, showing a distinctive structural and molecular phenotype. In this regard endothelial cells show decreased expression of CD31, together with enhanced NADPH diaphorase and von Willebrand factor (vWF) expression. Thus, suggesting that annuli endothelial cells are able to induce vasodilatation and to maintain an antithrombotic milieu. Smooth muscle cells in the annuli appeared reoriented embracing the origin of the collateral arteriole. This particular disposition could indicate a sphincter-like activity by bulging annuli cells to the arteriolar lumen. In addition, ultrastuctural analysis evidenced the existence of peg-and-socket junctions between smooth muscle cells of arteriolar annuli. This result suggests a stretch-coordinated annuli contraction. Furthermore, a possible reinforcement of basement membrane was evidenced by increased expression of its main components, including collagen IV, laminin and fibronectin. A diminished colocalization of collagen IV and laminin, suggest a change in the organization of basement membrane in arteriolar annuli. ICs have been described as a new cell population in the arteriolar annuli. These cells showed features matching the “gold standard” ultrastructural features established for the intestinal Interstitial Cajal cells identification. In addition, annuli presuntive Interstitial Cajal cells expressed specific markers of these cells, such as Ano1 and CD44, although c-kit expression could not be observed. A distinctive pattern of distribution of F-actin filaments, together with an increased expression of -actin and a lack of -SMA allowed further differentiation between annuli ICs and vascular smooth muscle cells. Functional studies suggest that annuli ICs perform functions of: pacemarker activity, neuromodulation and mechanotransduction. Blood flow alteration is an early event in retinal diseases, such as diabetic and hypertensive retinopathies, which are the two major causes of blindness and visual impairment worldwide. Thus, the function of arterial annuli and their alterations during retinopathy could be of interest in order to understand the physiopathology of vascular retinopathy. The analyisis of arteriolar annuli in model of diabetes type II (db/db mice) evidenced impaired glycogen storage in annuli ICs. In addition, the studies in a model of hypertension (KAP transgenic mice) evidenced a decreased expression of Ano1 in annuli ICs during hypertensive retinopathy, suggesting a loss of function of calcium-activated chloride channels. Thus, alterations observed in the retinal ICs could induce an impaired function of arteriolar annuli driving to dysregulation of blood flow during retinopathy. Moreover, arterial annuli are present in man retina. Preliminary results, as happens in mice, may suggest its alteration during retinopathy Taken together, obtained results suggest that arteriolar annuli are endowed with specific molecular, structural and functional characteristics which allow playing a key role in the retinal blood flow regulation in health and during retinopathy.