Péptidos derivados del GB virus C como potenciales inhibidores del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1

Abstract

En los últimos años, se han dedicado numerosos esfuerzos al desarrollo de nuevos fármacos inhibidores de la entrada del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (HIV-1) en la célula huésped. La principal ventaja de este tipo de inhibidores es que actúan como profilácticos, es decir pueden evitar la infección primaria y la integración del genoma viral en el genoma de la célula huésped. Esto implica una reducción del riesgo de sufrir efectos secundarios, y además, se evita el establecimiento y el mantenimiento de reservorios virales latentes.

Estudios recientes han demostrado que pacientes coinfectados por los virus GBV-C y HIV-1, tienen una progresión más lenta de la enfermedad del SIDA (Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida) así como una mayor supervivencia. Los estudios realizados, hasta el momento, indican que existe un mecanismo múltiple por el que la infección del GBV-C ejerce un “efecto protector” en los pacientes infectados con HIV-1. Empleando un modelo de co-infección, se ha observado que el virus GBV-C puede inhibir la replicación del HIV-1 así como la entrada de este último en las células. Según los estudios publicados ciertas regiones peptídicas de las glicoproteínas estructurales E1 y E2 del GBV-C presentan un efecto inhibidor frente al virus del HIV-1, y parece ser que interaccionan con el péptido de fusión de la glicoproteína de envoltura gp41 del virus (PF-HIV-1).

Teniendo en cuenta dichos resultados, uno de los objetivos de esta tesis doctoral es el diseño y la síntesis de derivados peptídicos pertenecientes a la región (22-39) de la proteína de envoltura E1 del virus GBV-C (E1P8), la cual en estudios previos ha mostrado una cierta actividad inhibitoria del virus del HIV-1. Se pretende mejorar la actividad antiviral del dominio peptídico E1P8 y así abordar el diseño de nuevos péptidos inhibidores de la entrada del virus del HIV-1. Se pretende evaluar el efecto de los diferentes aminoácidos en la estructura primaria de la secuencia nativa, y de su carga neta, en la actividad anti-HIV-1 del péptido E1P8. Con esta finalidad, se ha realizado un “scanning” posicional mediante la síntesis de 23 péptidos lineales, análogos del E1P8, en los que se ha sustituido cada uno de los aminoácidos de la secuencia original por alanina, y cambiado la carga neta del péptido mediante la sustitución de aminoácidos cargados por aminoácidos neutros. A continuación, se ha llevado a cabo el diseño y la síntesis de nuevas formas de presentación peptídica (varios lipopéptidos y un péptido cíclico). El estudio de la interacción entre los derivados peptídicos del E1P8 y el PF-HIV-1 se ha realizado mediante ensayos biofísicos, utilizando modelos de membrana. Para ello, se han utilizado técnicas fluorimétricas, Balanza de Langmuir, Microscopia de fluorescencia, Dicroísmo Circular y Resonancia de Plasmón Superficial.

La actividad biológica de los péptidos se ha estudiado utilizando ensayos celulares y ensayos de inhibición de replicación del virus HIV-1. Los resultados obtenidos permiten concluir que tanto la estructura primaria como la carga neta de E1P8 son esenciales para su actividad anti-HIV-1. Los lipopéptidos interaccionan con el PF-HIV-1 e inhiben la infección del HIV-1 con una mayor actividad que la secuencia nativa. El péptido E1P8 ciclado es el que presenta la mejor actividad inhibitoria del virus HIV-1, por lo que podría considerarse como punto de partida para el diseño de péptidos derivados del GBV-C con aplicación en futuras terapias anti-HIV-1.

Interest in the use of synthetic peptides as inhibitors of HIV-1 fusión and entry is growing significantly, given that they are applicable in combined therapies or when resistance to other antiretroviral drugs is seen and that they act before the virus enters the cell.

Recently it has been shown that the coinfection with GBV-C virus and HIV-1 has been associated with slower progression of the illness. Several studies have been published to propose different models of interaction between GBV-C and HIV-1. One of the proposed mechanisms by which GBV-C modulates HIV-1 infection involves inhibiting HIV-1 replication in vitro by GBV-C proteins. In our hands, certain peptide sequences of the E1 envelope protein of the GBV-C virus, as E1P8, inhibit HIV-1 entry, and appear to interact with HIV-1 fusion peptide (FP-HIV-1).

Based on these findings, the aim of present thesis is to carry out the design and synthesis of peptides, derivatives of the P8 region of the envelope protein E1 GBV-C, as HIV-1 inhibitors. In order to perform a systematic trial on the structure-activity relationship of these sequences, E1P8 peptide analogues were analyzed in which each of the amino acid residues was replaced by L-Ala. The influence of the total net load of the peptides on the activity through the replacement of residues loaded with neutral amino acids was also studied. Then, the design and synthesis of new strategies of peptide presentation as lipopeptides and cyclic peptide also was performed. The study of interaction between peptide derivatives E1P8 GBV-C and FP-HIV-1 is carried out through biophysical assays with membrane models, cellular assays and finally testing with HIV-1 infection.

The results indicate that the primary structure and the net charge of E1P8 influence the activity of the peptide. Lipopeptides interact with FP-HIV-1 and inhibit HIV-1 infectivity better than the native sequence. Although the cyclic E1P8 presents higher inhibitory activity of HIV-1, suggesting that this peptide could be best candidate for use in future antiviral therapies.