Bioluminescence Imaging for the Evaluation and Development of New Biomaterials for Tissue Engineering

Abstract

El desarrollo de biomateriales para ingeniería de tejido es un campo muy complejo y prolífico que en el que se combinan la ingeniería de materiales, la química, la biología celular y la medicina. Cada año se publican nuevas y prometedoras ideas que requieren de estudios in vivo e in vitro antes de realizar pruebas clínicas. Por desgracia, las condiciones in vitro son muy diferentes a las de la vida real y muchas de estas prometedoras ideas fracasan cuando son probadas en animales. El número de combinaciones posibles de tipos celulares, factores y biomateriales es inmenso, por lo que sería de gran ayuda establecer plataformas que permitan identificar las combinaciones óptimas para la obtención de características clave, como podría ser la capacidad angiogénica, o la inducción de la diferenciación celular a un determinado linaje. En esta tesis se demuestra el gran potencial de la imagen bioluminescente no invasiva (BLI) para analizar las interacciones célula‐scaffold in vivo. BLI permite monitorizar en tiempo real el número de células y su distribución en el scaffold, así como cambios en la expresión de ciertos genes mediante el uso de promotores inducibles tejido‐específicos. Esto proporciona información muy útil sobre el comportamiento in vivo del scaffold y sobre qué características deberían ser mejoradas para obtener los resultados deseados. Combinando esta información en tiempo real con otras tecnologías de imagen es posible obtener una visión completa sobre el comportamiento del material. Como “prueba de principio” de la aplicación de BLI para la evaluación de scaffolds para reparación tisular se han utilizado dos materiales muy diferentes, desarrollados por nuestros colaboradores. En el primer caso se ha demostrado la capacidad angiogénica de un nuevo material compuesto de ácido poliláctico (PLA) y vidrio de fosfato cálcico (CaP). Los resultados de BLI, que muestran que la inclusión de las partículas de CaP mejora la capacidad angiogénica del material, fueron validados mediante inmunohistoquímica. En el segundo caso se ha evaluado un scaffold de fibrina diseñado para liberar factores de crecimiento (GFs) utilizando un modelo murino de regeneración ósea. Los resultados de BLI mostraron que este scaffold induce la diferenciación osteoblástica, pero no endotelial, en células mesenquimales (MSCs) centinela. Estos resultados fueron corroborados mediante μCT, que mostró que la liberación de GFs da lugar no sólo a la formación de hueso más grueso, sino también a la formación de estructuras vasculares más densas. Mediante la combinación de BLI y μCT se pudo comprobar que las MSCs centinelas no se diferencian a linaje endotelial pero tienen un papel relevante en la inducción de conexiones intravasculares. Entender la respuesta de las células a cambios físicos (fuerzas de cizalla, hipoxia, etc.) dentro de los scaffolds puede ayudar al desarrollo de scaffolds para aplicaciones específicas. Inspirados por estas consideraciones iniciamos un ambicioso proyecto para desarrolla un minibioreactor para el análisis de las interacciones entre scaffolds y las células sin tener que recurrir a animales vivos. Este biorreactor, basado en la misma plataforma de bioluminiscencia, permite el análisis en tiempo real de la supervivencia y la diferenciación celular dentro de los biomateriales bajo flujo dinámico, pudiendo ser utilizado como paso intermedio entre los estudios in vitro e in vivo, agilizando los ciclos de diseño ‐ prueba‐rediseño de los scaffolds. Por otra parte, los biorreactores son cada vez más importantes en la ingeniería de tejidos ya que permiten la producción segura y reproducible de tejidos para aplicaciones clínicas. Este dispositivo, monitorizado por BLI, puede ser una herramienta muy útil para optimizar la siembra de células en los scaffolds, permitiendo la cuantificación de la supervivencia celular y la visualización de su distribución a lo largo del scaffold bajo condiciones de cultivo customizables. Se ha diseñado un prototipo de biorreactor utilizando un scaffold modelo y se ha utilizado para visualizar satisfactoriamente la siembra de MSCs, su distribución y su supervivencia bajo diferentes condiciones, así como su diferenciación en respuesta a agentes inductores.

Biomaterial development for Tissue Engineering is a very complex and prolific research field overlapping material engineering, chemistry, cell biology and medicine fields; every year promising new devises comprising materials, growth factors and cells are reported that require in vitro and in vivo studies previous to clinical evaluation. Unfortunately, in vitro conditions are very far removed from those in real life and many initially promising devices fail when tested in live animals. The number of possible combinations between cell types, factors and biomaterials is so large that testing platforms that can rapidly screen and identify optimal formulas, e.g., that emphasize key characteristics such as angiogenic capacity or promotion of differentiation to specific lineages would facilitate devise development. In this thesis we demonstrated the potential of noninvasive bioluminescence imaging (BLI) to analyze cellscaffold interactions in live animals. BLI allows the real‐time monitoring of cell number and distribution within the scaffolds. Furthermore, by using tissue‐specific inducible promoters, changes in expression of specific genes related to cell differentiation or hypoxic state can also be monitored. This provides very useful information about the scaffold behavior in vivo and about what characteristics should be improved to obtain the desired results. By combining the real‐time data from this bioluminescence platform with other end point imaging technologies, it is possible to obtain a full vision of the biomaterial behavior. We used two very different biomaterials developed by collaborators to illustrate as “proof of principle” the application of in vivo BLI technology in the evaluation of bio‐engineered scaffolds for tissue repair. In the first case we proved the angiogenic capacity of a new composite biomaterial comprising poly(lactic acid) (PLA) and calcium phosphate (CaP) glass. Our BLI results, indicating that inclusion of CaP particles on PLA improved the angiogenic capacity of the material, were also validated using standard immunofluorescent staining and histological procedures for vessel quantification. In the second case, we evaluated a GF‐delivering fibrin scaffold engineered for bone repair using a mice bone regeneration model. Our BLI results indicated that the GF‐delivering material had the capacity to induce osteoblastic, but not endothelial, differentiation in sentinel mesenchymal stem cells. Our BLI results were corroborated by μCT analysis that showed not only that thicker bone, but also denser vascular structures were induced by the delivery of GF. Again, the combination of BLI and μCT analysis indicated that sentinel cells while not differentiating to the endothelial lineage, did have a relevant paracrine role inducing abundant intervascular connections. Understanding the response of cells within biomaterials to changing physical parameters (e.g.: response to shear stress, hypoxia etc.) is valuable information to guide the development of scaffolds for specific applications. Inspired by these considerations we initiated an ambitious approach to develop a minibioreactor system useful for the analysis of cell‐scaffold interactions without having to resort to live animals. This bioreactor system, based in the same bioluminescent platform, allows real‐time analysis of cell survival and differentiation within the biomaterial under dynamic flow conditions and it could be considered as an intermediate step between in vitro and in vivo studies, facilitating the biomaterial design‐test‐redesign cycle. This type of device is important due to additional considerations. Bioreactors are becoming increasingly more important as they allow safe and reproducible production of scaffold‐tissue composites for clinical applications. Thus, BLI monitored system could also be a useful tool for designing and optimizing cell seeding of scaffolds; allowing the quantification of cell survival, and the visualization of cell distribution along the scaffold under customizable culture conditions. We have made progress in this area also, and a small bioreactor prototype comprising a model biomaterial was constructed and successfully used to illustrate cells distribution and survival under dynamic seeding conditions, as well as proliferation and differentiation in response to inducing agents.