Estudi d’un procés de mort cel·lular induït per una activació no canònica de les caspases caracteritzat per la presència de morfologies necròtiques

Abstract

La definició clàssica de la mort apoptòtica estableix la presència d’una morfologia nuclear apoptòtica de tipus II (condensació de la cromatina i fragmentació del nucli) i la degradació oligonucleosomal de l’ADN o LMW (low molecular weight). Les cèl·lules derivades de neuroblastoma humà SH-SY5Y presenten aquest fenotip de mort després de ser sotmeses a un estímul citotòxic com, per exemple, l’estaurosporina. En aquest treball demostrem que les cèl·lules SH-SY5Y pateixen un procés de mort cel·lular de forma homogènia amb un fenotip nuclear no apoptòtic després de ser tractades amb l’alcaloide pertanyent a la família de les benzofenantridines, queleritrina. Aquest fenotip nuclear no apoptòtic també és observat en altres línies cel·lulars derivades de neuroblastoma humà després de ser tractades amb queleritrina. A més, establim que aquest alcaloide tampoc és capaç d’induir la degradació oligonucleosomal de l’ADN, inclús quan s’estan assolint percentatges de mort més elevats que en el tractament amb estaurosporina. Per altra banda, demostrem que la manifestació del fenotip nuclear no apoptòtic succeeix de forma primerenca i depenent de l’activació anticipada de les caspases, en un procés de mort cel·lular que es desencadena ràpidament. En aquest context, l’increment d’expressió dels nivells de CAD, la principal endonucleasa responsable de la degradació apoptòtica de l’ADN i de la morfologia nuclear de tipus II, no restableix el fenotip apoptòtic en les cèl·lules tractades amb queleritrina. A més, demostrem que les cèl·lules SH-SY5Y manifesten el fenotip de mort no apoptòtic induït per l’alcaloide malgrat CAD es trobi a la fracció cromatínica. Per altra banda, establim que el procés de mort cel·lular induït per queleritrina coincideix amb la manifestació de les propietats intercalants d’aquest alcaloide sobre l’ADN. En aquest aspecte, mostrem que altres agents d’unió a l’ADN, a l’igual que queleritrina, impedeixen la manifestació del fenotip apoptòtic provocat per estaurosporina. A més, trobem que els agents d’unió a l’ADN pertanyents a la mateixa família que queleritrina (benzofenantridines), com la sanguinarina, també indueixen l’activació prematura de les caspases. Per altra banda, el procés de mort desencadenat per queleritrina s’evita quan diferents antioxidants tiòlics s’afegeixen al medi de cultiu. A més a més, aquest fet coincideix en què queleritrina provoca que un elevat percentatge de cèl·lules pateixin estrès oxidatiu de forma anticipada mitjançant la detecció d’espècies reactives de l’oxigen (ROS). Per últim, l’addició de determinades concentracions de DTT (dithiothreitol), un antioxidant tiòlic, retarda l’activació de caspases i recupera la morfologia apoptòtica de tipus II en cèl·lules tractades amb queleritrina. En aquestes condicions, en canvi, no s’observa cap signe de degradació oligonucleosomal de l’ADN. Aquest fet coincideix en què les propietats intercalants de queleritrina sobre l’ADN encara es mantenen. Tot plegat, el conjunt dels resultats obtinguts en aquest treball estableix que els processos d’estrès oxidatiu i les propietats d’unió a l’ADN són determinants en la manifestació de diferents fenotips de mort. Així, una producció prematura de ROS podria associar-se amb una activació anticipada de les caspases, fet que seria contraproduent per la consecució d’un fenotip apoptòtic canònic en la cèl·lula destinada a morir. Per altra banda, les propietats intercalants sobre l’ADN d’una determinada molècula, per exemple, un quimioteràpic, estaria desafavorint l’acció enzimàtica de CAD sobre la cromatina respecte a la fragmentació en doble cadena de l’ADN per generar fragments oligonucleosomals, però no la capacitat d’aquesta per facilitar la compactació i fragmentació del nucli durant l’estímul citotòxic. En conclusió, el procés de mort cel·lular induït per queleritrina esdevé una eina de manifesta rellevància que ens permet l’exploració de nous procesos de mort cel·lular i, per tant, l’estudi de mecanismes moleculars que puguin estar implicats en l’evasió de la mort apoptòtica canònica.

The classic definition of apoptotic cell death ascertains the presence of type II apoptotic nuclear morphology (chromatin condensation and fragmentation of the nucleus) and oligonucleosomal DNA degradation or LMW (low molecular weight). Cells derived from human neuroblastoma SH-SY5Y have this cell death phenotype upon a cytotoxic stimulus as for example estaurosporine. In the present study, we demonstrate that the SH-SY5Y cells undergo a process of cell death in a homogeneous way with a nuclear non-apoptotic phenotype after the challenge with a benzophenanthridine alkaloid, chelerythrine. This nuclear non-apoptotic phenotype is also shown in other cell lines derived from human neuroblastoma upon the chelerythrine treatment. In addition, we establish that this alkaloid is not able to induce the oligonucleosomal DNA degradation, even when the cell death percentages reached are higher than the values obtained with treatment of estaurosporine. On the other hand, we show that the non-apoptotic nuclear phenotype appears early. It depends on anticipatory activation of caspases in a cell death process which triggers quickly. In this context, the increase of CAD levels expression, the main endonuclease responsible for DNA apoptotic degradation and nuclear morphology of type II, does not restore the apoptotic phenotype after the treatment with chelerythrine. Moreover, we demonstrate that the SH-SY5Y cells show the non-apoptotic cell death phenotype induced by the alkaloid although CAD is located in the chromatin-enriched fraction. Besides this, we ascertain that the cell death induced by chelerythrine is concomitant with the presence of DNA intercalating properties from this alkaloid. In this sense, we show that other DNA binding agents, just like chelerythrine, avoid the apoptotic phenotype induced by estaurosporine. Furthermore, we find that the DNA binding agents belonging to the same family that chelerithrine (benzophenanthridine), such as sanguinarine, also induce a premature activation of caspases. On the other hand, the presence of different thiolic antioxidants in the culture media prevents the cell death process triggered by chelerythrine. Moreover, this fact coincides with a high percentage of cells undergoes an early oxidative stress through detection of reactive oxygen species (ROS). Finally, the addition to the culture media of certain DTT (dithiothreitol) concentrations, a thiolic antioxidant, delays the caspases activation and restores the apoptotic morphology of type II, after the treatment with chelerythrine. Altogether, the results obtained from this work ascertain that the oxidative stress processes and DNA binding properties are crucial to the induction of different cell death phenotypes. Thus, an early ROS production relates to a premature activation of caspases, which would be counter-productive to achieve a canonical apoptotic phenotype in cells destined to die. Furthermore, the DNA intercalating properties from one particular compound, such as chemotherapeutic agent, would disadvantage the CAD enzymatic action of double-strand DNA fragments on chromatin degradation to generate the oligonucleosomals fragments. However, the DNA intercalating properties would not be able to avoid the compaction and fragmentation of the nucleus during cytotoxic stimulus. In conclusion, the cell death process induced by chelerythrine becomes an important tool that allows us to explore new processes of cell death and, therefore, to study the molecular pathways involved in evasion to the canonical apoptotic death.