Caracterización de la proliferación celular en las zonas subventriculares y de la evolución del infarto mediante espectroscopía de resonancia magnética en un modelo preclínico de isquemia cerebral

Abstract

El ictus es una patología con una elevada incidencia en la población y los pacientes afectados sufren secuelas que les causan algún tipo de discapacidad. A nivel terapéutico, la posibilidad de incidir sobre la evolución de la enfermedad es a día de hoy aún escasa. Se ha descrito que la neurogénesis, la generación de nuevas neuronas con capacidad para migrar a la zona afectada, aumenta en las zonas subventriculares (ZSVs) y el hipocampo tras un infarto cerebral, en modelos animales y en humanos. Ante este panorama, los estudios dedicados a la comprensión de los mecanismos fisiopatológicos de la neurorreparación, así como el diseño de terapias que incidan sobre dichos mecanismos pueden ser de interés para la mejora de la calidad de vida de los pacientes tras sufrir un ictus. Actualmente se están desarrollando diversas terapias dedicadas a estimular la neurogénesis endógena, la mayoría a nivel preclínico. Una de las necesidades actuales para poder realizar ensayos clínicos sobre neurogénesis en el futuro, sería disponer de biomarcadores que permitieran detectar y monitorizar la neurogénesis de forma no invasiva. Ello nos permitiría conocer las variables asociadas a una mejor o peor capacidad de reparación, observar cómo varía esta capacidad a lo largo del tiempo, cómo varía con la administración de diversos tratamientos y cómo se relaciona esta actividad con el resultado funcional a corto y largo plazo tras un infarto cerebral. La espectroscopía de resonancia magnética (ERM) es una técnica que permite la evaluación bioquímica, in vivo, del tejido de interés de forma no invasiva, incluso permite la obtención de imágenes moleculares de las distribución de un metabolito en el cerebro. No obstante, antes de poder trasladar estos conocimientos al campo clínico, es necesario validar dichos biomarcadores espectroscópicos en modelos animales que permitan correlacionarlos con técnicas inmunohistoquímicas o de microscopía (las actuales técnicas de referencia para la determinación de la neurogénesis). En esta tesis se han desarrollado protocolos de ERM para la caracterización del patrón espectral tanto para las ZSVs como para la zona de infarto en un modelo oclusión transitoria de la arteria cerebral media en rata. Además, para una caracterización metabolómica más precisa, se aplicaron otras técnicas de resonancia que podían permitir una mejor resolución espectral, como el análisis de biopsias de tejido mediante resonancia magnética de alto campo High Resolution Magic Angle Spinning (HRMAS) previo sacrificio de los animales por irradiación con microondas focalizadas (FMW) para detener el metabolismo post mortem. También se utilizaron herramientas informáticas de reconocimiento de patrones para la determinación de los metabolitos con características diferenciales de las ZSVs y la evolución del infarto en base al análisis simultáneo de varios metabolitos. Asimismo, se realizaron pruebas con el fármaco Citicolina para verificar si la técnica permitía detectar cambios en el patrón espectroscópico en las regiones de interés debido a la administración del fármaco. El uso de estas técnicas ha permitido determinar posibles biomarcadores relacionados con apoptosis en la zona de infarto y proliferación en la ZSVs así como la valoración de los efectos de la Citicolina en el patrón metabólico correlacionando los hallazgos espectroscópicos con análisis inmunohistoquímico Los resultados obtenidos ponen de relieve el potencial de la ERM en el análisis bioquímico para determinar biomarcadores con potencial traslacional a la práctica clínica aplicables a futuros estudios en el campo del ictus.

Stroke is a disease with a high incidence in the population and the affected patients have sequelae that cause disabilities. From a therapeutic point of view, the possibility of treating the evolution of the disease is nowadays still limited. Neurogenesis, the generation of new neurons with the capacity of migrating to the injured region, has been described to increase in the subventricular zones (SVZs) and hippocampus post-stroke, in animal models and also in humans. That is why studies dedicated to the understanding of the neurorepair physiopathology and the design of new therapies that could influence their mechanisms could be of interest for improving the quality of life of the patients after suffering a stroke. New therapies to promote endogenous neurogenesis enhancement are currently being developed, most of them in preclinical studies. One of the needs to develop neurogenesis clinical trials in the future is to determine biomarkers that would detect and monitor neurogenesis noninvasively. This could be useful to identify associated variables with a better or worse repair capacity, how this capacity changes over time and with pharmacological treatment and how this activity correlates with functional outcome in early and late stages post-stroke. Magnetic resonance spectroscopy (MRS) is a noninvasive technique that allows metabolic profile analysis of the tissue of interest in vivo. Moreover, it allows to perform metabolic imaging of the metabolite distribution through the brain. However, before using spectroscopic biomarkers in the clinical field they must be validated in animal models so that they can be correlated with immunohistochemistry or microscopy (the actual gold standard techniques to determine neurogenesis). In this work MRS protocols were developed to characterize the spectroscopic pattern for the SVZs and also for the stroke zone in a transient middle cerebral artery occlusion rat model. Also, for a more accurate metabolomic characterization with better spectral resolution, other magnetic resonance techniques were applied like biopsy analysis with High Resolution Magic Angle Spinning (HRMAS) using prior focused microwave irradiation (FMW) animal sacrifice in order to arrest post-mortem metabolism. In addition, pattern recognition software was applied to determine feature differences between SVZs or stroke evolution using simultaneous analysis of several metabolites. MRS experiments were performed using a therapeutic agent (Citicoline) to determine if changes in the spectroscopic pattern due to drug administration could be detected. The combination of these techniques has allowed to determine potential biomarkers associated to apoptosis in the stroke zone and proliferation in the SVZs and also to determine Citicoline effects in the metabolic pattern correlating the spectroscopic findings with immunohistochemistry analysis. The results highlight that MRS is a useful technique to perform biochemical analysis to determine biomarkers with translational potential to the clinical practice that could be used for future studies in stroke.